以下是植物SOD酶活性测定的主要方法及实验要点，综合相关文献整理如下：
一、NBT光还原法（最常用）
原理
核黄素在光照下产生超氧阴离子（O₂⁻），将无色NBT还原为蓝色甲臜（560nm有最大吸收峰）。SOD清除O₂⁻后可抑制甲臜生成，酶活性越强，蓝色越浅。
实验步骤
酶液提取
取植物鲜样0.3–0.5g，加入预冷的磷酸缓冲液（pH 7.8）冰浴研磨。
匀浆离心（4℃，10,000×g，15min），上清液为粗酶液，低温保存。
反应体系配制
试剂 终浓度 添加量（例）
磷酸缓冲液（pH 7.8） 50 mmol/L 1.5 ml
甲硫氨酸（Met） 13 mmol/L 0.3 ml
NBT溶液 75 μmol/L 0.3 ml
EDTA-Na₂溶液 10 μmol/L 0.3 ml
核黄素溶液 2 μmol/L 0.3 ml
酶液 - 0.05 ml
蒸馏水 - 0.25 ml
（总体积3.0 ml）
反应与测定
混匀后，1支对照管遮光，其余管置于4000 lux光照下反应20min（25–35℃）。
立即遮光终止反应，560nm测吸光度（A₅₆₀），以遮光管调零。
活性计算
SOD活性(U/g FW)=(Ack−AE)×VTAck×0.5×W×VsSOD活性(U/g FW)=Ack×0.5×W×Vs(Ack−AE)×VT
AckAck：光照对照管吸光度；
AEAE：样品管吸光度；
VTVT：总酶液体积（ml）；
VsVs：反应所用酶液体积（ml）；
WW：样品鲜重（g）。
注：1个酶活单位（U）定义为抑制NBT光还原50%的酶量。
二、邻苯三酚自氧化法
原理
碱性条件下邻苯三酚自氧化生成红橘酚（O₂⁻参与），在325nm/420nm显色。SOD清除O₂⁻抑制自氧化，抑制率与酶活性正相关。
实验步骤
酶液提取
同NBT法（磷酸缓冲液pH 7.8或Tris-HCl缓冲液pH 8.2）。
反应体系
缓冲液（pH 8.2）2.35 ml + 蒸馏水2.00 ml + 邻苯三酚溶液（4.5 mmol/L）0.15 ml。
加入20μl酶液启动反应。
测定
325nm处记录1min内吸光度变化（ΔA₃₂₅），计算自氧化速率抑制率。
活性计算
SOD活性(U/g)=ΔA自氧化−ΔA样品ΔA自氧化×VW×稀释倍数SOD活性(U/g)=ΔA自氧化ΔA自氧化−ΔA样品×WV×稀释倍数
注：1个酶活单位（U）为抑制邻苯三酚自氧化速率50%的酶量。
一、NBT光还原法（最常用）
原理
核黄素在光照下产生超氧阴离子（O₂⁻），将无色NBT还原为蓝色甲臜（560nm有最大吸收峰）。SOD清除O₂⁻后可抑制甲臜生成，酶活性越强，蓝色越浅。
实验步骤
酶液提取
取植物鲜样0.3–0.5g，加入预冷的磷酸缓冲液（pH 7.8）冰浴研磨。
匀浆离心（4℃，10,000×g，15min），上清液为粗酶液，低温保存。
反应体系配制
试剂 终浓度 添加量（例）
磷酸缓冲液（pH 7.8） 50 mmol/L 1.5 ml
甲硫氨酸（Met） 13 mmol/L 0.3 ml
NBT溶液 75 μmol/L 0.3 ml
EDTA-Na₂溶液 10 μmol/L 0.3 ml
核黄素溶液 2 μmol/L 0.3 ml
酶液 - 0.05 ml
蒸馏水 - 0.25 ml
（总体积3.0 ml）
反应与测定
混匀后，1支对照管遮光，其余管置于4000 lux光照下反应20min（25–35℃）。
立即遮光终止反应，560nm测吸光度（A₅₆₀），以遮光管调零。
活性计算
SOD活性(U/g FW)=(Ack−AE)×VTAck×0.5×W×VsSOD活性(U/g FW)=Ack×0.5×W×Vs(Ack−AE)×VT
AckAck：光照对照管吸光度；
AEAE：样品管吸光度；
VTVT：总酶液体积（ml）；
VsVs：反应所用酶液体积（ml）；
WW：样品鲜重（g）。
注：1个酶活单位（U）定义为抑制NBT光还原50%的酶量。
二、邻苯三酚自氧化法
原理
碱性条件下邻苯三酚自氧化生成红橘酚（O₂⁻参与），在325nm/420nm显色。SOD清除O₂⁻抑制自氧化，抑制率与酶活性正相关。
实验步骤
酶液提取
同NBT法（磷酸缓冲液pH 7.8或Tris-HCl缓冲液pH 8.2）。
反应体系
缓冲液（pH 8.2）2.35 ml + 蒸馏水2.00 ml + 邻苯三酚溶液（4.5 mmol/L）0.15 ml。
加入20μl酶液启动反应。
测定
325nm处记录1min内吸光度变化（ΔA₃₂₅），计算自氧化速率抑制率。
活性计算
SOD活性(U/g)=ΔA自氧化−ΔA样品ΔA自氧化×VW×稀释倍数SOD活性(U/g)=ΔA自氧化ΔA自氧化−ΔA样品×WV×稀释倍数
注：1个酶活单位（U）为抑制邻苯三酚自氧化速率50%的酶量。
