一、脱片原因
1.玻片涂层失效：多聚赖氨酸（PLL）降解或涂抹不均，导致细胞附着不牢；
2.机械损伤：移液枪冲击、镊子刮擦破坏细胞层；
3.渗透压震荡：缓冲液盐浓度突变引发细胞收缩剥离；
4.温度骤变：高温固定后立即低温操作，热胀冷缩致玻片与细胞分离。
二、防脱片全流程
第一步：玻片预处理
1.玻片选择：使用带正电荷的防脱载玻片（如Thermo Fisher Superfrost Plus），或普通玻片经强酸浸泡（10% HNO₃ 过夜）去除油脂；
2.涂层制备： •多聚赖氨酸法：0.1% PLL溶液均匀铺满玻片，室温静置30分钟→吸除多余液体→37℃烘箱干燥2小时； •明胶法：1%明胶溶液（55℃溶解）涂片→37℃孵育1小时→PBS漂洗3次；
3.灭菌保存：紫外照射30分钟，4℃密封保存≤2周。
第二步：细胞铺板
1.接种密度：24孔板每孔接种5×10⁴个细胞（80%融合度），密度过低易脱片；
2.铺板技巧：沿孔壁缓慢滴加细胞悬液，避免直冲玻片中心；
3.贴壁时间：接种后静置培养箱30分钟再移动，让细胞初步贴附。
第三步：固定与通透
1.冷固定：弃培养基→预冷4%多聚甲醛（4℃）轻柔覆盖细胞，4℃固定30分钟（高温加速细胞脱落）；
2.梯度通透：PBS漂洗后，0.1% Triton X-100（含0.1%柠檬酸钠）4℃处理10分钟→立即转入PBS终止。
第四步：TUNEL反应
1.标记液加样：用宽口枪头沿孔壁缓慢加入50μl TUNEL反应混合液（含TdT酶和荧光素-dUTP）；
2.湿盒孵育：玻片置于铺有湿滤纸的密封盒内，37℃避光孵育1小时（湿度＞90%防干片）；
3.轻柔洗涤：PBS含0.05% Tween-20（PBST）浸泡漂洗3次，每次5分钟（禁止震荡摇床！）。
第五步：封片
1.抗淬灭剂选择：含DAPI的封片剂（如ProLong™ Diamond）兼具核染与防脱功能；
2.封片技巧： •吸干玻片边缘液体，滴加10μl封片剂； •用镊子以30°角倾斜放置盖玻片，避免气泡； •指甲油沿盖玻片边缘密封，4℃避光固化24小时。
三、紧急补救方案
1.局部脱片： •用细针蘸取少量封片剂修补脱落区域； •激光共聚焦扫描时避开损伤区。
2.大面积脱片： •将玻片浸入4% PFA 10分钟重新固定； •用0.01%多聚赖氨酸溶液补涂，37℃烘干1小时； •重新进行TUNEL标记（缩短孵育时间至40分钟）。
1.玻片涂层失效：多聚赖氨酸（PLL）降解或涂抹不均，导致细胞附着不牢；
2.机械损伤：移液枪冲击、镊子刮擦破坏细胞层；
3.渗透压震荡：缓冲液盐浓度突变引发细胞收缩剥离；
4.温度骤变：高温固定后立即低温操作，热胀冷缩致玻片与细胞分离。
二、防脱片全流程
第一步：玻片预处理
1.玻片选择：使用带正电荷的防脱载玻片（如Thermo Fisher Superfrost Plus），或普通玻片经强酸浸泡（10% HNO₃ 过夜）去除油脂；
2.涂层制备： •多聚赖氨酸法：0.1% PLL溶液均匀铺满玻片，室温静置30分钟→吸除多余液体→37℃烘箱干燥2小时； •明胶法：1%明胶溶液（55℃溶解）涂片→37℃孵育1小时→PBS漂洗3次；
3.灭菌保存：紫外照射30分钟，4℃密封保存≤2周。
第二步：细胞铺板
1.接种密度：24孔板每孔接种5×10⁴个细胞（80%融合度），密度过低易脱片；
2.铺板技巧：沿孔壁缓慢滴加细胞悬液，避免直冲玻片中心；
3.贴壁时间：接种后静置培养箱30分钟再移动，让细胞初步贴附。
第三步：固定与通透
1.冷固定：弃培养基→预冷4%多聚甲醛（4℃）轻柔覆盖细胞，4℃固定30分钟（高温加速细胞脱落）；
2.梯度通透：PBS漂洗后，0.1% Triton X-100（含0.1%柠檬酸钠）4℃处理10分钟→立即转入PBS终止。
第四步：TUNEL反应
1.标记液加样：用宽口枪头沿孔壁缓慢加入50μl TUNEL反应混合液（含TdT酶和荧光素-dUTP）；
2.湿盒孵育：玻片置于铺有湿滤纸的密封盒内，37℃避光孵育1小时（湿度＞90%防干片）；
3.轻柔洗涤：PBS含0.05% Tween-20（PBST）浸泡漂洗3次，每次5分钟（禁止震荡摇床！）。
第五步：封片
1.抗淬灭剂选择：含DAPI的封片剂（如ProLong™ Diamond）兼具核染与防脱功能；
2.封片技巧： •吸干玻片边缘液体，滴加10μl封片剂； •用镊子以30°角倾斜放置盖玻片，避免气泡； •指甲油沿盖玻片边缘密封，4℃避光固化24小时。
三、紧急补救方案
1.局部脱片： •用细针蘸取少量封片剂修补脱落区域； •激光共聚焦扫描时避开损伤区。
2.大面积脱片： •将玻片浸入4% PFA 10分钟重新固定； •用0.01%多聚赖氨酸溶液补涂，37℃烘干1小时； •重新进行TUNEL标记（缩短孵育时间至40分钟）。
