CCK8实验注意事项一、试剂使用与保存1.避光保存：试剂需在-20℃避光保存，避免反复冻融；使用前需平衡至室温以维持活性。2.防污染操作：移液需使用无菌枪头，避免微生物污染导致试剂失效。二、细胞处理要点1.细胞密度优化：贴壁细胞建议每孔接种500-10000个（毒性实验需更高密度，增殖实验可适当降低）。预实验确定最佳细胞量，避免过密（营养耗尽导致假阴性）或过稀（信号弱）。2.均匀铺板：细胞悬液需充分混匀，接种时每加5孔后吹打一次防止沉淀。边缘孔加入PBS或培养基以减少蒸发干扰。3.预培养稳定：贴壁细胞需预培养2-6小时后再加试剂，悬浮细胞可直接实验8。三、实验操作规范1.试剂添加：每孔加10μL CCK8溶液，避免产生气泡（可调节移液器档位至“吸二档打一档”）若培养基体积变化（如原体积200μL），需按比例调整CCK8用量2.孵育时间控制：常规孵育1-4小时，每隔2小时检测吸光度，OD值控制在1.0左右为宜。显色不足或过久均影响结果准确性。四、干扰因素排除1.背景干扰处理：含酚红培养基或高浓度血清需设置空白对照（培养基+CCK8，无细胞）。有色药物需提前检测吸光度干扰，必要时换液后再加CCK8。2.数据校正：计算细胞存活率或抑制率时，需扣除空白孔吸光度（公式：存活率=As−AbAs−Ab/Ac−AbAc−Ab×100%）。五、其他关键细节1.复孔设置：每组设置4-6个复孔，药物浓度梯度需3个复孔取均值。2.仪器校准：酶标仪检测波长建议450nm，双波长检测可选参考波长600-650nm。总结：CCK8实验需严格把控细胞密度、试剂活性及操作规范，通过预实验优化条件，并合理设置对照以排除干扰，确保数据可靠性。