一、实验原理与材料准备
1. 染色原理 油红O是一种脂溶性偶氮染料，可与中性脂质（如甘油三酯、胆固醇酯）特异性结合，在光学显微镜下呈现红色或橙红色颗粒，直观显示组织或细胞内的脂质沉积。
2. 核心试剂与仪器
•试剂清单：
•油红O原液（0.5%油红O异丙醇溶液，4℃避光保存）
•60%异丙醇溶液（分化液）
•4%多聚甲醛（固定液）
•苏木素染液（细胞核复染）
•PBS缓冲液（pH 7.4）
•抗封片剂（甘油明胶或水性封片剂）
•仪器设备：
•光学显微镜（推荐配备数码成像系统）
•冰冻切片机（组织样本需切片）
•湿盒、移液器、避光染缸
二、实验操作步骤
Step 1：样本制备与固定
•细胞样本：
1.将细胞接种于培养皿或爬片上，待密度达80%时处理（如诱导脂肪变性）；
2.吸弃培养基，PBS轻柔漂洗3次，去除残留血清；
3.加入4%多聚甲醛，室温固定20-30分钟。
•组织样本：
1.取新鲜组织（如肝脏）速冻于OCT包埋剂，-80℃保存；
2.制作5-8 μm厚冰冻切片，贴附于载玻片；
3. 4%多聚甲醛固定10分钟，PBS漂洗。
注意事项：
•固定时间过长可能导致脂质流失，建议不超过30分钟；
•避免使用含有机溶剂的固定液（如乙醇）以免溶解脂质。
Step 2：油红O染色液配制
1.工作液配制：
•取0.5%油红O原液与去离子水按3:2比例混合（例如：6 mL原液 + 4 mL水），充分摇匀后静置10分钟；
•使用前用0.22 μm滤膜过滤，去除沉淀（关键步骤！）。
2.储存：现用现配，避免久置导致染料结晶。
Step 3：染色与分化
1.染色步骤：
•将固定后的样本浸入60%异丙醇中孵育5分钟（脱水并增强染色渗透性）；
•转移至油红O工作液，避光染色10-15分钟（室温）；
•迅速用60%异丙醇分化5-10秒，去除非特异性吸附。
2.水洗：流水轻柔冲洗5秒，终止分化。
关键点：
•分化时间需严格把控，镜下观察至背景透明、脂滴鲜红为宜；
•染色液需完全覆盖样本，避免干燥导致染料沉淀。
Step 4：细胞核复染与封片
1.苏木素复染：
•浸入苏木素染液1-2分钟，流水返蓝5分钟；
2.封片： •用滤纸吸去多余水分，滴加水性封片剂，加盖玻片（避免气泡）；
•或直接甘油明胶封片，显微镜观察。
三、图像采集与结果判读
1. 显微镜观察
•脂滴定位：红色/橙红色颗粒位于胞质内（如脂肪肝切片中肝细胞脂滴弥漫分布）；
•正常对照：阴性样本仅见浅蓝色背景，无红色信号。
2. 图像分析 •定性分析：根据染色深浅和分布范围评估脂质沉积程度；
•定量分析（推荐）：
1.使用ImageJ软件：
•打开图像→转换为8-bit灰度→设定阈值（区分阳性区域）→ Analyze Particles统计脂滴面积占比；
2.数据导出：比较不同处理组脂滴面积/细胞面积的百分比。
四、常见问题与解决方案
1.背景过深或非特异性染色
•原因：分化不充分或染色液未过滤。
•对策：延长分化时间至15秒，染色前务必过滤染料。
2.脂滴染色模糊或缺失
•原因：固定时间过长或样本脱水不足。
•对策：固定时间控制在20分钟内，60%异丙醇脱水需彻底。
3.染料沉淀干扰观察
•原因：染色液静置不足或过滤不彻底。
•对策：配制后静置10分钟，双重过滤（0.45 μm + 0.22 μm滤膜）。
4.苏木素复染过深掩盖脂滴
•原因：复染时间过长或苏木素浓度过高。
•对策：复染时间缩短至1分钟，稀释苏木素染液。
5.封片后脂滴褪色
•原因：水性封片剂渗透或光照氧化。
•对策：改用中性树脂封片，样本避光保存。