大家好，今天跟大家分享一篇题为”Genomic and single-cell landscape reveals novel drivers and therapeutic vulnera bilities of transformed cutaneous T-cell lymphoma“ 文章的多组学分析数据提供了第一个全面的tCTCL基因组改变综合纲要，并确定了难治愈 T 细胞淋巴瘤潜在的预后特征和创新治治疗方向。
01
研究背景
皮肤 T 细胞淋巴瘤 （CTCL） 是一种罕见的皮肤归巢 T 细胞癌。一部分患者发生大细胞转化，并迅速进展为侵袭性淋巴瘤。在这里，我们使用跨全外显子组测序 （WES）、单细胞 RNA 测序和免疫分析的综合多组学在 56 名患者的独特队列中研究了转化的 CTCL （tCTCL） 肿瘤生态系统。
70 例皮肤活检的 WES 显示肿瘤突变负荷高、对生存有预后的 UV 特征、基于外显子组的驱动事件以及 tCTCL 中最常见的突变通路。16 例 tCTCL 皮肤活检的单细胞分析确定了一个核心致癌程序，具有氧化磷酸化 （OXPHOS） 的代谢重编程、细胞可塑性、MYC 和 E2F 活性的上调以及 MHC I 的下调，提示免疫逃逸。
使用 OXPHOS 和 MYC 抑制剂的药理学扰动显示出强大的抗肿瘤活性，而免疫分析提供了表达巨噬细胞迁移抑制因子的恶性 T 细胞与表达 CD74 的巨噬细胞和表达 CD74 的 B 细胞之间细胞间通讯的原位证据。
见图一
转化的 CTCL 的基因组景观。
图一
A，一个显示 tCTCL 患者队列的流程图（n = 56 名经活检证实的 tCTCL 患者，包括 53 名转化的 MF 和 3 名 SS/重叠的 MF-SS 与皮肤中的 TT）和相关生物样本研究。WES（n = 54 名 tCTCL 患者，70 名福尔马林固定、石蜡包埋的皮肤活检）：45 名 TT 患者，25 名 PP 患者（其中 9 名是转化的 PP）。*，n = 17 例患者匹配转化的肿瘤和 PP （前体或并发 PP;方法）。同时进行 5' scRNA-seq 和 scV（D）J-seq（n = 8 名 tCTCL 患者，每名患者同时患有 TT 和 PP）。通过 Vectra 进行多重 IF 免疫分析（n = 21 名 tCTCL 患者，64 个 TMA 核心;**，n = 16 名具有匹配 TT 和 PP 的患者（方法）。TT 的临床照片（左;PT11） 和广泛的 PP（右）。
B ，33 种 TCGA 癌症类型和 tCTCL（红色）、SS-Choi（蓝色）和 SS-Wang（蓝色）队列的每 MB TMB。样本量在顶部注释。
C、该图表示使用 deconstructSig 在每个组织样本中 COSMIC v3.2 突变特征 SBS7a、SBS7b、SBS7c 和其他特征的加权贡献（参考文献 38;n = 70 个样本）。
D，根据高与低 SBS7 突变特征 （通过 SBS7a-d 的加权贡献之和） 和 LCT 发作与死亡时间或最后一次随访分类的 tCTCL 患者的总体生存概率。
E，黑人/AA 与非黑人/AA 患者 SBS7a-d 突变特征的加权贡献。
F，黑人/AA 与非黑人/AA 患者每个样本的突变谱与 COSMIC v3.2 突变特征之间的余弦相似性的热图，按 SBS7a-d 排序（补充图 S3B 中的完整 COSMIC v3.2 特征）。
G 和 H，dNdScv 和 MutsigCV 预测的驱动基因 （G） 和 tCTCL 中最常发生突变的通路基因 （H） 的 Oncoplot（n = 70 个样本）。每列代表一个患者肿瘤样本。描述了体细胞突变，包括错义（绿色）、无义（红色）、框内插入（深灰色）和缺失（浅蓝色）、移码插入（橙色）和缺失（蓝色）、剪接位点（黄色）、多重打击（紫色）以及通过手动管理与白血病和淋巴瘤有关的基因（红色星号）。TT（品红色）、PP（灰色）。描述了 >10% 样本中的复发突变（补充表 S5 和 S6 中的完整突变列表）。预测的驱动基因属于五组：细胞周期、染色质修饰、细胞运动、细胞凋亡、与白血病/淋巴瘤发生有关的基因 （*） 和其他未定义的基因 （G）。最常发生的突变通路是 Hippo、Notch、RAS-RTK 通路和 p53 （H;补充表 S6）。
见图二
tCTCL 表现出与 SS/白血病 CTCL 不同的基因组增益和损失。
图二
A 一个WES 使用胃肠道 2.0 检测驱动癌症生长的 SCNA 靶向基因，从而对显著的手臂水平和局灶性 SCNA 进行复合图。转化的 CTCL （tCTCL;top， n = 55 个具有匹配种系的样品）。SS/白血病 CTCL36（下图，n = 31 个具有匹配种系的样品）。每个改变都分配有一个 G 分数（y 轴;频率×振幅）。扩增（红色，水平实线上方）和缺失（蓝色，水平实线下方）绘制在基因组（x 轴）上。描述了峰区域内的选定基因靶标。Q 阈值 = 0.25。
B 检查文献中报道的 55 个 CTCL 相关基因（主要是 SS;参考文献 19）和 tCTCL 中显著差异突变的基因（左，n = 55 个样本）与 SS/白血病 CTCL（参考文献 36;右，n = 31 个样本;P < 0.05，q < 0.25）。描述了参与 DNA 损伤反应、JAK-STAT、染色质修饰、T 细胞活化、细胞周期、免疫监视、PI3K、MAPK、T 细胞分化、NFκB、细胞骨架反应、T 细胞迁移）的精选候选基因，以及来自 tCTCL 和 SS 队列之间无偏倚比较的显著差异突变基因（补充表 S8 中的完整基因列表）。
见图三
以单细胞分辨率解剖转换后的 CTCL TIME。
图三
A 一个单细胞分析分析工作流程。从 8 例 CD4+ tCTCL （成对 TT 和 PP 病灶） 患者中收集 16 例新鲜皮肤活检，用于互补 5′ scRNA-seq 和 scV（D）J-seq。单细胞 V（D）J-seq （10× 铬）可检测定义每个 T 细胞 TCR 克隆型的精确 TCR α链和β链组合。“真恶性”细胞（红色）= 具有显性 TCR 克隆型的细胞，而“真良性”细胞（绿色）= 具有非显性/多克隆 TCR 克隆型的细胞（补充表 S9）。B，恶性细胞通过推断的大规模 CNA （inferCNV） 进一步鉴定。CNA（红色，扩增;蓝色，缺失）沿着每个细胞的染色体显示。三分之二随机选择的非显性 TCR/多克隆 CD4 + 或 CD8 + T 细胞作为良性“参考细胞”输入。对于 inferCNV 观察组，剩余的 1/3 的“真良性”细胞被“加标”，以及所有克隆性“真恶性”细胞和 CD3 阳性的“没有 TCR 读数的细胞”（灰色）（即“恶性疑似”细胞，黄色）作为输入细胞。在 tCTCL TIME 中，TCR 克隆性的“真恶性”细胞显示恶性 CNV 模式，而“真良性”细胞显示 CNV 中性模式。
C、27,055 个免疫细胞（点）的单细胞图谱 UMAP，按恶性细胞状态着色（左上），恶性 T 细胞（红色）与良性免疫细胞（绿色）簇、患者 ID（右上）以及 TIME 中注释的所有恶性 T 细胞和良性免疫细胞类型（下;补充方法）。
见图四
tCTCL 中的恶性 T 细胞致癌程序和体外 OXPHOS 和 MYC 的药物抑制。
图四
A ，一个将 TT 中的恶性 T 细胞与良性 CD4+ T 细胞进行比较的基因集富集分析 （GSEA） 显示 OXPHOS、MYC、EMT （细胞可塑性/干性） 和 E2F 靶途径中的基因显着富集，并下调 IFNγ 、 TNFα 和 IFNα。标准化富集评分 （NES;x 轴）反映富集程度，并允许跨基因集进行比较。列出的通路按其 NES 排名，并按其重要性着色。
B，GSEA.TT 中的恶性 T 细胞与 PP 中的恶性 T 细胞的比较显示 OXPHOS、MYC 和 E2F 靶途径中的基因上调，以及 PP 到 TT 中 IFNγ 和 IFNα 通路的下调。
C、恶性 T 细胞致癌程序 DEGs。来自 55 个基因的 tCTCL 恶性 T 细胞致癌程序（y 轴、行、补充表 S12 中的完整列表）中选定基因在分析细胞（列）、TT（洋红色）和良性 CD4+ T 细胞（绿色）中的恶性 T 细胞中的缩放表达。右侧的彩条表示显著富集的通路。用 q 值< 0.05 且倍数变化 （FC） 绝对值> 2 或 <0.5 （方法） 过滤显著的 DEGs。
D，Monocle 3 的 tCTCL TIME 成分在伪时间中的轨迹。用于降维和可视化的 UMAP，包括之前在图 3中注释的所有细胞。C. 图形界面中的朴素 CD4 + T 细胞被指定为根节点，伪时间的细胞轨迹是使用 Monocle 3 的默认参数（learn_graph 函数）学习的。学习的轨迹揭示了从良性 T 细胞到 PP 中的恶性 T 细胞（灰色）再到 TT 中的恶性 T 细胞（品红色;右）的单向性。选择从初始 CD4+ T 细胞到恶性 T 细胞的轨迹分支（choose_graph_segments函数，左，紫色分支），并沿伪时间绘制 55 个基因恶性 T 细胞致癌程序的动力学，选择基因显示在底部面板中（补充图 S8 中的完整基因列表;补充表 S13）。scRNA-seq 数据集中注释的细胞类型以颜色点表示（例如，PP 中的恶性 T 细胞，灰色;TT 中的恶性 T 细胞，品红色）。CXCL13 （趋化因子）、SLC25A5 （OXPHOS）、NME2 （MYC） 显示从良性 T 细胞到恶性 PP 的协调上调，而 EPCAM 和 TWIST （EMT/细胞可塑性） 显示肿瘤轨迹末端基因表达的增强。HLA-A 和 HLA-B （MHC-I） 的下调发生在伪时间 PP 从良性转为恶性分叉的早期。
E，HLA-A、C、E、F 基因表达在 TT（品红色）、PP 中恶性 T 细胞（灰色）和良性 CD4+ T 细胞（绿色）中 HLA-A、C、E、F 基因表达分布的小提琴图。，P < 0.001。
F，T 细胞淋巴瘤细胞系，Myla （MF）、Jurkat （ATLL）、HH （白血病 CTCL）、MJ （ATLL） 和 Hu78 （SS）。OXPHOS 抑制剂 （IACS-010759） 细胞凋亡测定（左）：将指示的细胞系接种在 96 孔板上，并用 8 nmol/L 的 IACS-010759 处理 5 天。第 5 天，收获细胞并按照制造商的方案（BioLegend;货号 #640914）用 Annexin V 和 PI 染色。膜联蛋白 V<b122< b122="">使用 FlowJo 10 软件对单重态种群进行 >+PI+ 种群门控。数据被归一化为车辆控制。误差线表示 SEM ±平均值。n = 8（MyLa 和 Jurkat）;n = 4 （HH， MJ， Hu78）.MYC 抑制剂 （MYCi975） 细胞增殖测定（右）。将指示的细胞系接种在 96 孔板上，并用不同剂量的 MYCi975 处理 5 天。第 5 天，按照制造商的方案（Promega;货号 G3580）将细胞与 MTS 试剂一起孵育。记录 OD 490 nm 处的吸光度，并将生长百分比标准化为载体对照。使用 GraphPad Prism 8 的非线性回归函数，根据曲线拟合结果计算半数最大抑制浓度 （IC50）。该符号表示平均值。误差线，均值 ± SEM。n = 12 （MyLa 和 Jurkat）;n = 8（HH、MJ 和 Hu78）。
见图五
恶性 T 细胞与 tCTCL TIME 之间的细胞串扰突出了 MIF-CD74 相互作用。
图五
A一个通过将 CellPhoneDB v2.0（细胞-细胞通信信息学管道）与 scRNA-seq 数据集（左;相互作用细胞类型之间的潜在受体-配体对）集成，概述了恶性 T 细胞与巨噬细胞/单核细胞、B 细胞、树突状细胞、内皮细胞和成纤维细胞之间具有统计学意义的受体-配体相互作用（左;相互作用的细胞类型之间的潜在受体-配体对如顶部表示）。P 值的显著性由圆圈大小表示（−对数10P 值，排列检验;方法）。颜色表示两种相互作用的细胞类型之间受体-配体对的 log2 均值。Scale （比例） 显示在右侧。示意图（右）表示恶性 T 细胞中的 MIF 与巨噬细胞/单核细胞和 B 细胞中 CD74 在 tCTCL 时间内预测的顶级预测配体-受体相互作用。
B 和 C，通过 mIF 免疫分析实现 MIF 表达和 MIF-CD74 共定位（80 个核心 TMA）。病变类型：PP-NT（PP 来自未转化患者，n = 16 个组织核心）、PP-P（来自 tCTCL 患者的前体 PP，n = 12 个核心）、PP-C（来自 tCTCL 患者的并发 PP，n = 12 个核心）和 TT（n = 64 个核心）。将多层 TIFF 图像从 InForm （Akoya Biosciences） 导出到 HALO 图像分析平台 （Indica Labs） 中进行分割和定量分析。乙，MIF （红色）、CD74 （天蓝色）、CD3 （绿色）、Ki-67 （深蓝色）、CD68 （黄色）。恶性 CD4+ T 细胞 （CD3+ CD8− Ki-67 高）。巨噬细胞（CD68 + 细胞）。恶性 T 细胞中的 MIF（左），恶性 T 细胞中的 MIF 与巨噬细胞中的 CD74 共定位（白色箭头，中间）。箱形图描述了针对每种病变类型的 MIF-CD74 共定位密度 （y 轴，每 mm2 计数）。C、MIF （红色）、CD74 （天蓝色）、CD3 （绿色）、Ki-67 （深蓝色）、PAX5 （黄色）。恶性 CD4+ T 细胞 （CD3+ CD8− Ki-67 高）。B 细胞（PAX5 + 细胞）。恶性 T 细胞中的 MIF（左），恶性 T 细胞中的 MIF 与 B 细胞中的 CD74 共定位（白色箭头，中间）。箱形图显示针对每种病变类型的 MIF-CD74 共定位密度（y 轴，每 mm2 的细胞计数）。
D，TT（左）在恶性 CD4+ T 细胞（CD3+ CD8− Ki-67 高）之间有 B 细胞（PAX5+，黄色）密集浸润。来自未转化患者（中）的厚 PP 病灶在 TIME 上显示 PAX5+ B 细胞缺失。Ki-67 细胞（深蓝色）描绘表皮的基底层。箱形图描述了针对每种病变类型的 B 细胞密度（y 轴，每 mm2 的细胞计数）。
见图六
tCTCL 中的显性亚克隆显示核糖体基因表达失调。
图六
A 一个通过分区分层聚类树 （inferCNV、HMM 亚簇模式、“qnorm” 方法）鉴定每位患者恶性 T 细胞中的遗传亚克隆。CNA（红色，扩增;蓝色，缺失）沿着每个细胞的染色体显示。右侧的彩条表示匹配的 UMAP 集群注释、患者 ID 和缩放的表达式。
B，按基因表达聚类（左）并由患者 ID 标记（右）的所有恶性 T 细胞的 UMAP 图揭示了 PT11（簇 1、11 和 12）、PT35（簇 0、3 和 9）和 PT50（簇 4 和 8;补充表 S17）。UMAP 群集和患者 ID （PTID） 在右侧进行颜色编码。
C、PT35 （左） 和 PT11 （右） 中恶性 T 细胞亚簇的 DEG 显示，在这两名临床结果最差的患者中，编码核糖体蛋白大亚基和小亚基的基因在主要恶性 T 细胞亚克隆中显著上调。
02
研究结论
罕见癌症是癌症研究中最大的不平等之一，缺乏精心策划的组织标本来研究疾病生物学和药物开发资源。转化的 CTCL 就是这种挑战的例证，其中缺乏基因组和转录组水平的信息导致药物发现工作的缺乏。在这项研究中，我们确定了 tCTCL 中潜在的遗传驱动事件和通路，并阐明了具有潜在新型治疗脆弱性的恶性 T 细胞致癌程序。尽管需要在更大的队列和临床前模型中进一步验证，但我们的调查提供了一个关键资源，其中包含迄今为止研究的最大 tCTCL 样本集合。我们预计这项研究的结果可以外推到其他 T 细胞淋巴瘤，并将有助于引入新的免疫治疗策略来对抗这种目前无法治愈的癌症。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
皮肤 T 细胞淋巴瘤 （CTCL） 是一种罕见的皮肤归巢 T 细胞癌。一部分患者发生大细胞转化，并迅速进展为侵袭性淋巴瘤。在这里，我们使用跨全外显子组测序 （WES）、单细胞 RNA 测序和免疫分析的综合多组学在 56 名患者的独特队列中研究了转化的 CTCL （tCTCL） 肿瘤生态系统。
70 例皮肤活检的 WES 显示肿瘤突变负荷高、对生存有预后的 UV 特征、基于外显子组的驱动事件以及 tCTCL 中最常见的突变通路。16 例 tCTCL 皮肤活检的单细胞分析确定了一个核心致癌程序，具有氧化磷酸化 （OXPHOS） 的代谢重编程、细胞可塑性、MYC 和 E2F 活性的上调以及 MHC I 的下调，提示免疫逃逸。
使用 OXPHOS 和 MYC 抑制剂的药理学扰动显示出强大的抗肿瘤活性，而免疫分析提供了表达巨噬细胞迁移抑制因子的恶性 T 细胞与表达 CD74 的巨噬细胞和表达 CD74 的 B 细胞之间细胞间通讯的原位证据。
见图一
转化的 CTCL 的基因组景观。
图一
A，一个显示 tCTCL 患者队列的流程图（n = 56 名经活检证实的 tCTCL 患者，包括 53 名转化的 MF 和 3 名 SS/重叠的 MF-SS 与皮肤中的 TT）和相关生物样本研究。WES（n = 54 名 tCTCL 患者，70 名福尔马林固定、石蜡包埋的皮肤活检）：45 名 TT 患者，25 名 PP 患者（其中 9 名是转化的 PP）。*，n = 17 例患者匹配转化的肿瘤和 PP （前体或并发 PP;方法）。同时进行 5' scRNA-seq 和 scV（D）J-seq（n = 8 名 tCTCL 患者，每名患者同时患有 TT 和 PP）。通过 Vectra 进行多重 IF 免疫分析（n = 21 名 tCTCL 患者，64 个 TMA 核心;**，n = 16 名具有匹配 TT 和 PP 的患者（方法）。TT 的临床照片（左;PT11） 和广泛的 PP（右）。
B ，33 种 TCGA 癌症类型和 tCTCL（红色）、SS-Choi（蓝色）和 SS-Wang（蓝色）队列的每 MB TMB。样本量在顶部注释。
C、该图表示使用 deconstructSig 在每个组织样本中 COSMIC v3.2 突变特征 SBS7a、SBS7b、SBS7c 和其他特征的加权贡献（参考文献 38;n = 70 个样本）。
D，根据高与低 SBS7 突变特征 （通过 SBS7a-d 的加权贡献之和） 和 LCT 发作与死亡时间或最后一次随访分类的 tCTCL 患者的总体生存概率。
E，黑人/AA 与非黑人/AA 患者 SBS7a-d 突变特征的加权贡献。
F，黑人/AA 与非黑人/AA 患者每个样本的突变谱与 COSMIC v3.2 突变特征之间的余弦相似性的热图，按 SBS7a-d 排序（补充图 S3B 中的完整 COSMIC v3.2 特征）。
G 和 H，dNdScv 和 MutsigCV 预测的驱动基因 （G） 和 tCTCL 中最常发生突变的通路基因 （H） 的 Oncoplot（n = 70 个样本）。每列代表一个患者肿瘤样本。描述了体细胞突变，包括错义（绿色）、无义（红色）、框内插入（深灰色）和缺失（浅蓝色）、移码插入（橙色）和缺失（蓝色）、剪接位点（黄色）、多重打击（紫色）以及通过手动管理与白血病和淋巴瘤有关的基因（红色星号）。TT（品红色）、PP（灰色）。描述了 >10% 样本中的复发突变（补充表 S5 和 S6 中的完整突变列表）。预测的驱动基因属于五组：细胞周期、染色质修饰、细胞运动、细胞凋亡、与白血病/淋巴瘤发生有关的基因 （*） 和其他未定义的基因 （G）。最常发生的突变通路是 Hippo、Notch、RAS-RTK 通路和 p53 （H;补充表 S6）。
见图二
tCTCL 表现出与 SS/白血病 CTCL 不同的基因组增益和损失。
图二
A 一个WES 使用胃肠道 2.0 检测驱动癌症生长的 SCNA 靶向基因，从而对显著的手臂水平和局灶性 SCNA 进行复合图。转化的 CTCL （tCTCL;top， n = 55 个具有匹配种系的样品）。SS/白血病 CTCL36（下图，n = 31 个具有匹配种系的样品）。每个改变都分配有一个 G 分数（y 轴;频率×振幅）。扩增（红色，水平实线上方）和缺失（蓝色，水平实线下方）绘制在基因组（x 轴）上。描述了峰区域内的选定基因靶标。Q 阈值 = 0.25。
B 检查文献中报道的 55 个 CTCL 相关基因（主要是 SS;参考文献 19）和 tCTCL 中显著差异突变的基因（左，n = 55 个样本）与 SS/白血病 CTCL（参考文献 36;右，n = 31 个样本;P < 0.05，q < 0.25）。描述了参与 DNA 损伤反应、JAK-STAT、染色质修饰、T 细胞活化、细胞周期、免疫监视、PI3K、MAPK、T 细胞分化、NFκB、细胞骨架反应、T 细胞迁移）的精选候选基因，以及来自 tCTCL 和 SS 队列之间无偏倚比较的显著差异突变基因（补充表 S8 中的完整基因列表）。
见图三
以单细胞分辨率解剖转换后的 CTCL TIME。
图三
A 一个单细胞分析分析工作流程。从 8 例 CD4+ tCTCL （成对 TT 和 PP 病灶） 患者中收集 16 例新鲜皮肤活检，用于互补 5′ scRNA-seq 和 scV（D）J-seq。单细胞 V（D）J-seq （10× 铬）可检测定义每个 T 细胞 TCR 克隆型的精确 TCR α链和β链组合。“真恶性”细胞（红色）= 具有显性 TCR 克隆型的细胞，而“真良性”细胞（绿色）= 具有非显性/多克隆 TCR 克隆型的细胞（补充表 S9）。B，恶性细胞通过推断的大规模 CNA （inferCNV） 进一步鉴定。CNA（红色，扩增;蓝色，缺失）沿着每个细胞的染色体显示。三分之二随机选择的非显性 TCR/多克隆 CD4 + 或 CD8 + T 细胞作为良性“参考细胞”输入。对于 inferCNV 观察组，剩余的 1/3 的“真良性”细胞被“加标”，以及所有克隆性“真恶性”细胞和 CD3 阳性的“没有 TCR 读数的细胞”（灰色）（即“恶性疑似”细胞，黄色）作为输入细胞。在 tCTCL TIME 中，TCR 克隆性的“真恶性”细胞显示恶性 CNV 模式，而“真良性”细胞显示 CNV 中性模式。
C、27,055 个免疫细胞（点）的单细胞图谱 UMAP，按恶性细胞状态着色（左上），恶性 T 细胞（红色）与良性免疫细胞（绿色）簇、患者 ID（右上）以及 TIME 中注释的所有恶性 T 细胞和良性免疫细胞类型（下;补充方法）。
见图四
tCTCL 中的恶性 T 细胞致癌程序和体外 OXPHOS 和 MYC 的药物抑制。
图四
A ，一个将 TT 中的恶性 T 细胞与良性 CD4+ T 细胞进行比较的基因集富集分析 （GSEA） 显示 OXPHOS、MYC、EMT （细胞可塑性/干性） 和 E2F 靶途径中的基因显着富集，并下调 IFNγ 、 TNFα 和 IFNα。标准化富集评分 （NES;x 轴）反映富集程度，并允许跨基因集进行比较。列出的通路按其 NES 排名，并按其重要性着色。
B，GSEA.TT 中的恶性 T 细胞与 PP 中的恶性 T 细胞的比较显示 OXPHOS、MYC 和 E2F 靶途径中的基因上调，以及 PP 到 TT 中 IFNγ 和 IFNα 通路的下调。
C、恶性 T 细胞致癌程序 DEGs。来自 55 个基因的 tCTCL 恶性 T 细胞致癌程序（y 轴、行、补充表 S12 中的完整列表）中选定基因在分析细胞（列）、TT（洋红色）和良性 CD4+ T 细胞（绿色）中的恶性 T 细胞中的缩放表达。右侧的彩条表示显著富集的通路。用 q 值< 0.05 且倍数变化 （FC） 绝对值> 2 或 <0.5 （方法） 过滤显著的 DEGs。
D，Monocle 3 的 tCTCL TIME 成分在伪时间中的轨迹。用于降维和可视化的 UMAP，包括之前在图 3中注释的所有细胞。C. 图形界面中的朴素 CD4 + T 细胞被指定为根节点，伪时间的细胞轨迹是使用 Monocle 3 的默认参数（learn_graph 函数）学习的。学习的轨迹揭示了从良性 T 细胞到 PP 中的恶性 T 细胞（灰色）再到 TT 中的恶性 T 细胞（品红色;右）的单向性。选择从初始 CD4+ T 细胞到恶性 T 细胞的轨迹分支（choose_graph_segments函数，左，紫色分支），并沿伪时间绘制 55 个基因恶性 T 细胞致癌程序的动力学，选择基因显示在底部面板中（补充图 S8 中的完整基因列表;补充表 S13）。scRNA-seq 数据集中注释的细胞类型以颜色点表示（例如，PP 中的恶性 T 细胞，灰色;TT 中的恶性 T 细胞，品红色）。CXCL13 （趋化因子）、SLC25A5 （OXPHOS）、NME2 （MYC） 显示从良性 T 细胞到恶性 PP 的协调上调，而 EPCAM 和 TWIST （EMT/细胞可塑性） 显示肿瘤轨迹末端基因表达的增强。HLA-A 和 HLA-B （MHC-I） 的下调发生在伪时间 PP 从良性转为恶性分叉的早期。
E，HLA-A、C、E、F 基因表达在 TT（品红色）、PP 中恶性 T 细胞（灰色）和良性 CD4+ T 细胞（绿色）中 HLA-A、C、E、F 基因表达分布的小提琴图。，P < 0.001。
F，T 细胞淋巴瘤细胞系，Myla （MF）、Jurkat （ATLL）、HH （白血病 CTCL）、MJ （ATLL） 和 Hu78 （SS）。OXPHOS 抑制剂 （IACS-010759） 细胞凋亡测定（左）：将指示的细胞系接种在 96 孔板上，并用 8 nmol/L 的 IACS-010759 处理 5 天。第 5 天，收获细胞并按照制造商的方案（BioLegend;货号 #640914）用 Annexin V 和 PI 染色。膜联蛋白 V<b122< b122="">使用 FlowJo 10 软件对单重态种群进行 >+PI+ 种群门控。数据被归一化为车辆控制。误差线表示 SEM ±平均值。n = 8（MyLa 和 Jurkat）;n = 4 （HH， MJ， Hu78）.MYC 抑制剂 （MYCi975） 细胞增殖测定（右）。将指示的细胞系接种在 96 孔板上，并用不同剂量的 MYCi975 处理 5 天。第 5 天，按照制造商的方案（Promega;货号 G3580）将细胞与 MTS 试剂一起孵育。记录 OD 490 nm 处的吸光度，并将生长百分比标准化为载体对照。使用 GraphPad Prism 8 的非线性回归函数，根据曲线拟合结果计算半数最大抑制浓度 （IC50）。该符号表示平均值。误差线，均值 ± SEM。n = 12 （MyLa 和 Jurkat）;n = 8（HH、MJ 和 Hu78）。
见图五
恶性 T 细胞与 tCTCL TIME 之间的细胞串扰突出了 MIF-CD74 相互作用。
图五
A一个通过将 CellPhoneDB v2.0（细胞-细胞通信信息学管道）与 scRNA-seq 数据集（左;相互作用细胞类型之间的潜在受体-配体对）集成，概述了恶性 T 细胞与巨噬细胞/单核细胞、B 细胞、树突状细胞、内皮细胞和成纤维细胞之间具有统计学意义的受体-配体相互作用（左;相互作用的细胞类型之间的潜在受体-配体对如顶部表示）。P 值的显著性由圆圈大小表示（−对数10P 值，排列检验;方法）。颜色表示两种相互作用的细胞类型之间受体-配体对的 log2 均值。Scale （比例） 显示在右侧。示意图（右）表示恶性 T 细胞中的 MIF 与巨噬细胞/单核细胞和 B 细胞中 CD74 在 tCTCL 时间内预测的顶级预测配体-受体相互作用。
B 和 C，通过 mIF 免疫分析实现 MIF 表达和 MIF-CD74 共定位（80 个核心 TMA）。病变类型：PP-NT（PP 来自未转化患者，n = 16 个组织核心）、PP-P（来自 tCTCL 患者的前体 PP，n = 12 个核心）、PP-C（来自 tCTCL 患者的并发 PP，n = 12 个核心）和 TT（n = 64 个核心）。将多层 TIFF 图像从 InForm （Akoya Biosciences） 导出到 HALO 图像分析平台 （Indica Labs） 中进行分割和定量分析。乙，MIF （红色）、CD74 （天蓝色）、CD3 （绿色）、Ki-67 （深蓝色）、CD68 （黄色）。恶性 CD4+ T 细胞 （CD3+ CD8− Ki-67 高）。巨噬细胞（CD68 + 细胞）。恶性 T 细胞中的 MIF（左），恶性 T 细胞中的 MIF 与巨噬细胞中的 CD74 共定位（白色箭头，中间）。箱形图描述了针对每种病变类型的 MIF-CD74 共定位密度 （y 轴，每 mm2 计数）。C、MIF （红色）、CD74 （天蓝色）、CD3 （绿色）、Ki-67 （深蓝色）、PAX5 （黄色）。恶性 CD4+ T 细胞 （CD3+ CD8− Ki-67 高）。B 细胞（PAX5 + 细胞）。恶性 T 细胞中的 MIF（左），恶性 T 细胞中的 MIF 与 B 细胞中的 CD74 共定位（白色箭头，中间）。箱形图显示针对每种病变类型的 MIF-CD74 共定位密度（y 轴，每 mm2 的细胞计数）。
D，TT（左）在恶性 CD4+ T 细胞（CD3+ CD8− Ki-67 高）之间有 B 细胞（PAX5+，黄色）密集浸润。来自未转化患者（中）的厚 PP 病灶在 TIME 上显示 PAX5+ B 细胞缺失。Ki-67 细胞（深蓝色）描绘表皮的基底层。箱形图描述了针对每种病变类型的 B 细胞密度（y 轴，每 mm2 的细胞计数）。
见图六
tCTCL 中的显性亚克隆显示核糖体基因表达失调。
图六
A 一个通过分区分层聚类树 （inferCNV、HMM 亚簇模式、“qnorm” 方法）鉴定每位患者恶性 T 细胞中的遗传亚克隆。CNA（红色，扩增;蓝色，缺失）沿着每个细胞的染色体显示。右侧的彩条表示匹配的 UMAP 集群注释、患者 ID 和缩放的表达式。
B，按基因表达聚类（左）并由患者 ID 标记（右）的所有恶性 T 细胞的 UMAP 图揭示了 PT11（簇 1、11 和 12）、PT35（簇 0、3 和 9）和 PT50（簇 4 和 8;补充表 S17）。UMAP 群集和患者 ID （PTID） 在右侧进行颜色编码。
C、PT35 （左） 和 PT11 （右） 中恶性 T 细胞亚簇的 DEG 显示，在这两名临床结果最差的患者中，编码核糖体蛋白大亚基和小亚基的基因在主要恶性 T 细胞亚克隆中显著上调。
02
研究结论
罕见癌症是癌症研究中最大的不平等之一，缺乏精心策划的组织标本来研究疾病生物学和药物开发资源。转化的 CTCL 就是这种挑战的例证，其中缺乏基因组和转录组水平的信息导致药物发现工作的缺乏。在这项研究中，我们确定了 tCTCL 中潜在的遗传驱动事件和通路，并阐明了具有潜在新型治疗脆弱性的恶性 T 细胞致癌程序。尽管需要在更大的队列和临床前模型中进一步验证，但我们的调查提供了一个关键资源，其中包含迄今为止研究的最大 tCTCL 样本集合。我们预计这项研究的结果可以外推到其他 T 细胞淋巴瘤，并将有助于引入新的免疫治疗策略来对抗这种目前无法治愈的癌症。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
