1、引物最好在模板cDNA 的保守区内设计
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAman)比对
(Alignment)，各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2、引物长度一般在15~30碱基之间
引物长度(primer length)常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应。
3、引物GC含量在40%~60%之间， Tm 值最好接近72℃
GC含量(composition )过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值(melting temperature )是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4
( G+C)+2 (A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳
4、引物3’端要避开密码子的第3位
如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率
5、引物3’端不能选择A，最好选择T
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T
时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3’端最好选择T
6、碱基要随机分布
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发
7、引物自身及引物之间不应存在互补序列
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免31端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer 与Cross dimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAman)比对
(Alignment)，各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2、引物长度一般在15~30碱基之间
引物长度(primer length)常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应。
3、引物GC含量在40%~60%之间， Tm 值最好接近72℃
GC含量(composition )过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值(melting temperature )是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4
( G+C)+2 (A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳
4、引物3’端要避开密码子的第3位
如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率
5、引物3’端不能选择A，最好选择T
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T
时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3’端最好选择T
6、碱基要随机分布
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发
7、引物自身及引物之间不应存在互补序列
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免31端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer 与Cross dimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补
