今天和大家分享一篇发表在Nature上关于「铁死亡」的文章，题为：A non-canonical vitamin k cycle is a potent ferroptosis suppressor。
文章的作者是慕尼黑亥姆霍兹中心发育遗传学研究所的Marcus Conrad博士研究团队。
铁死亡介绍
铁死亡是2012年由哥伦比亚大学Brent. R. Stockwell实验室发现的一种铁依赖性的新型细胞程序性死亡方式，在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和磷脂发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡。
铁代谢和脂质过氧化是铁死亡的两大核心，当过量的二价铁离子在细胞内积累时，会因为芬顿反应使细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，产生大量ROS，从而诱导细胞死亡。
而细胞中谷胱甘肽过氧化物酶GPX4是唯一可还原脂质过氧化的酶，一旦GPX4失活，就会导致脂质过氧化，最终导致铁死亡。
（DOI: 10.1016/j.cell.2022.06.003）
在过去的几年里，铁死亡被认为是阿尔茨海默病和许多其他疾病中急性器官损伤的驱动因素。预防细胞的铁死亡，被认为是治疗许多退行性疾病的一种非常有前景的方法，因此，许多科学家们正在广泛地探索调控铁死亡的新机制和化合物。
抵御铁死亡的三大氧化还原系统
细胞内存在多种高效的氧化还原系统，如（半）胱氨酸/GSH/GPX4轴、NAD(P)H/FSP1/CoQ10系统和GCH1/BH4/DHFR系统，它们参与中和细胞内过多的脂质过氧化物，维持细胞及机体的氧化还原平衡。
多年来，胱氨酸/GSH/GPX4系统被认为是防御铁死亡的唯一手段。半胱氨酸是谷胱甘肽合成的限速底物，为谷胱甘肽（GSH）合成的重要组成部分。GPX4使用GSH作为底物，可将细胞毒性脂质氢过氧化物（L-OOH）还原为L-OH，抑制GPX4活性会导致细胞膜脂质过氧化物的积累。
2019年，Marcus Conrad博士及其研究团队在Nature上发表文章“FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor”，确定了一种新型的、强有力的铁死亡抑制蛋白1（FSP1），可以将CoQ10还原为对苯二酚，并且通过豆蔻酰化修饰发挥抗铁死亡功能。NAD(P)H/FSP1 /CoQ10通路作为一个独立的平行系统存在，与GPX4和谷胱甘肽协同抑制磷脂过氧化和铁死亡。
近期一项研究确定了一种不依赖于GPX4的铁死亡抑制机制：GCH1/BH4/DHFR机制。该研究通过CRISPR全基因组筛选并确定了一种不依赖于GPX4的铁死亡抑制基因，即鸟苷三磷酸环水解酶GCH1（四氢生物蝶呤BH4合成的限速酶）。BH4是一种自由基捕获抗氧化剂，但它的回收再利用需要二氢叶酸还原酶DHFR的参与，因此如果阻断二氢叶酸还原酶DHFR，则可协同GPX4抑制剂发挥诱导铁死亡的作用。
（DOI: 10.1016/j.cmet.2020.10.011）
Nature这篇文章还挺有意思，他们是想看看除了上述这些有效预防铁死亡的内在和外在机制之外，是否还有其他调节系统能抑制铁死亡的。
由于铁死亡与脂质氧化相关，因此，研究团队计划从具有抗氧化作用的天然维生素及其衍生物中寻找能够调控铁死亡的分子。
研究成果
（1）维生素K是有效的铁死亡抑制剂
他们首先利用他莫昔芬(TAM)诱导小鼠胚胎成纤维细胞（称为Pfa1细胞）GPX4缺失，然后进行天然维生素化合物筛选，发现除了维生素E最强的生物活性形式α-生育酚(α-TOH)外，只有三种形式的维生素K【叶绿醌（PK），甲基萘醌-4（MK4）和甲基萘醌（menad）】可以帮助细胞抵抗Gpx4缺失诱导的铁死亡，这种抑制作用在人的癌细胞中也有效。
研究人员又使用其他已知铁死亡诱导剂（包括GPX4抑制RSL3）诱导细胞，维生素K对这些诱导剂诱导的铁死亡也有抑制作用。
脂质过氧化是铁死亡的重要特征，作者通过检验细胞的脂质过氧化水平验证了维生素K族化合物可以通过来抑制脂质过氧化从而抑制铁死亡。
然后，研究人员使用GPX4基因遗传缺失的小鼠和病理模型测试维生素K是否也能在体内预防铁死亡。
由于MK4是最有效的衍生物，作者集中于此进行研究。
研究人员使用他莫昔芬诱导小鼠肝细胞敲除GPX4，然后用维生素K （MK4）处理，肝细胞特异性GPX4敲除小鼠在治疗后不久因广泛的肝坏死而死亡，用MK4能够延长小鼠的生存时间，并对肝细胞的病理，凋亡，铁死亡以及脂质氧化均有显著的抑制作用。
除了诱导敲除GPX4，还用了其他类似RSL3和Erastin等诱导的铁死亡，也能被MK4所抑制。
动物实验，也说明了维生素K之一的MK4，能有效抑制缺血再灌注过程中造成的铁死亡。
因此，研究人员得出结论：在相关的铁死亡体内模型中，药理学剂量的维生素K具有有效的抗铁死亡作用，可防止细胞死亡。
（2）FSP1通过维持维生素K还原形态（VKH2）作为自由基捕获剂发挥抗氧化作用
维生素K是一种具有氧化还原活性的萘醌，在已知的维生素K循环中转化为相应的氢醌 (VKH2)。据报道，VKH2是一种有效的RTA，除了作为 γ-谷氨酰羧化酶 (GGCX) 的辅助因子外，还可以防止脂质过氧化。
VK到VKH2需要有VKOR的催化，VKOR会被华法林（Warfarin）抑制。
华法林（Warfarin）是双香豆素衍生物，主要通过抑制维生素K环氧化物还原酶的活性来阻断维生素K的循环，减少VKH2的形成，进而影响维生素K-依赖凝血因子谷氨酰基的γ-羧化反应，导致凝血因子只能停留在没有生物活性的前体状态，最终导致机体凝血障碍。
这个时候，会有另一条非经典的通过NAD(P)H依赖的通路，将VK转化为VKH2，这个酶就是铁死亡抑制蛋白1（Ferroptosis suppressor protein 1, FSP1）。
FSP1(由AIFM2基因编码)是一种依赖于NAD(P)H的泛醌氧化还原酶，，是控制铁死亡的主要方式，通过催化泛醌还原为其氢醌形式消耗NAD(P)H，独立于GPX4发挥作用。
由于维生素K和泛醌具有相同的结构特性，研究进一步探究了FSP1是否可以作为维生素K还原酶，产生VKH2来抑制脂质过氧化。
他们使用重组人FSP1(recombinant human Fsp1)进行体外试验，当三种维生素K形式中的任何一种与rhFSP1和NADH共同孵育时，NADH被消耗，同时质谱结果显示MK4与rhFSP1和NADH共同孵育时会生成还原型维生素K，表明FSP1催化了维生素K的还原。
研究者通过fluorescence-enabled inhibited autoxidation assay(FENIX，荧光激活的抑制性自氧化测试)技术来研究维生素K对氧化脂质的还原能力，以及FSP1在其中的作用。
实验发现虽然叶绿醌、MK4和甲萘醌不能起到直接抑制脂质过氧化的作用，但在rhFSP1和NADH存在的情况下，三种形式的维生素K均能够有效抑制脂质过氧化。NADH本身不抑制脂质过氧化，但NADH的供应可通过FSP1延长三种维生素K对脂质过氧化的抑制时间。
（3）维生素K通过FSP1阻断铁死亡
研究人员进一步通过敲除细胞FSP1基因，发现PK和MK4对RSL3引起的铁死亡抑制作用明显减弱；FSP1表达的重建恢复了PK和MK4的抗铁死亡作用。
这证明了维生素K在发挥铁死亡抑制作用时需要FSP1的协助，GPX4和FSP1 双敲除的细胞需要比GPX4单敲除的细胞需要更高浓度的PK和MK4来预防铁死亡也证明了这一点。
研究者通过添加FSP1的抑制药物和华法林，来检验维生素K的铁死亡抑制作用，实验结果也证明通过抑制FSP1或敲除FSP1都会削弱维生素K对铁死亡的抑制作用，而华法林对FSP1发挥作用没有影响。
这些发现表明，FSP1参与维生素K的还原是PK和MK4抗铁死亡的原因。
然而，在FSP1抑制表达的细胞中，高剂量的PK和MK4仍然可以抑制铁死亡，这表明还有其他机制导致维生素K的转化。
（4）FSP1可避免华法林中毒
维生素K循环的通路中，华法林（Warfarin）是一种VKOR抑制剂。也就是说华法林阻断了维生素K后，会影响GGCX，引起血管破裂，一般这种情况下，会让患者补充大量维生素K。
由于FSP1是VK循环中促进VKH2的另一种激活途径。研究者验证FSP1是否在经典的GGCX–VKOR途径之外存在抗华法林的非经典维生素还原途径起作用。
在使用华法林后，加入rhFSP1，能促进VKH2的量。也就是说FSP1是另一条不能被华法林抑制的维生素K循环途径。
体内实验也证明了，FSP1能抑制华法林毒性。
在华法林抑制VK循环的情况下，FSP1和VKH2能激活整个VK循环，抑制华法林毒性。同时，激活了VK循环，通过GGCX抑制脂质过氧化，从而抑制铁死亡。
文章的作者是慕尼黑亥姆霍兹中心发育遗传学研究所的Marcus Conrad博士研究团队。
铁死亡介绍
铁死亡是2012年由哥伦比亚大学Brent. R. Stockwell实验室发现的一种铁依赖性的新型细胞程序性死亡方式，在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和磷脂发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡。
铁代谢和脂质过氧化是铁死亡的两大核心，当过量的二价铁离子在细胞内积累时，会因为芬顿反应使细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，产生大量ROS，从而诱导细胞死亡。
而细胞中谷胱甘肽过氧化物酶GPX4是唯一可还原脂质过氧化的酶，一旦GPX4失活，就会导致脂质过氧化，最终导致铁死亡。
（DOI: 10.1016/j.cell.2022.06.003）
在过去的几年里，铁死亡被认为是阿尔茨海默病和许多其他疾病中急性器官损伤的驱动因素。预防细胞的铁死亡，被认为是治疗许多退行性疾病的一种非常有前景的方法，因此，许多科学家们正在广泛地探索调控铁死亡的新机制和化合物。
抵御铁死亡的三大氧化还原系统
细胞内存在多种高效的氧化还原系统，如（半）胱氨酸/GSH/GPX4轴、NAD(P)H/FSP1/CoQ10系统和GCH1/BH4/DHFR系统，它们参与中和细胞内过多的脂质过氧化物，维持细胞及机体的氧化还原平衡。
多年来，胱氨酸/GSH/GPX4系统被认为是防御铁死亡的唯一手段。半胱氨酸是谷胱甘肽合成的限速底物，为谷胱甘肽（GSH）合成的重要组成部分。GPX4使用GSH作为底物，可将细胞毒性脂质氢过氧化物（L-OOH）还原为L-OH，抑制GPX4活性会导致细胞膜脂质过氧化物的积累。
2019年，Marcus Conrad博士及其研究团队在Nature上发表文章“FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor”，确定了一种新型的、强有力的铁死亡抑制蛋白1（FSP1），可以将CoQ10还原为对苯二酚，并且通过豆蔻酰化修饰发挥抗铁死亡功能。NAD(P)H/FSP1 /CoQ10通路作为一个独立的平行系统存在，与GPX4和谷胱甘肽协同抑制磷脂过氧化和铁死亡。
近期一项研究确定了一种不依赖于GPX4的铁死亡抑制机制：GCH1/BH4/DHFR机制。该研究通过CRISPR全基因组筛选并确定了一种不依赖于GPX4的铁死亡抑制基因，即鸟苷三磷酸环水解酶GCH1（四氢生物蝶呤BH4合成的限速酶）。BH4是一种自由基捕获抗氧化剂，但它的回收再利用需要二氢叶酸还原酶DHFR的参与，因此如果阻断二氢叶酸还原酶DHFR，则可协同GPX4抑制剂发挥诱导铁死亡的作用。
（DOI: 10.1016/j.cmet.2020.10.011）
Nature这篇文章还挺有意思，他们是想看看除了上述这些有效预防铁死亡的内在和外在机制之外，是否还有其他调节系统能抑制铁死亡的。
由于铁死亡与脂质氧化相关，因此，研究团队计划从具有抗氧化作用的天然维生素及其衍生物中寻找能够调控铁死亡的分子。
研究成果
（1）维生素K是有效的铁死亡抑制剂
他们首先利用他莫昔芬(TAM)诱导小鼠胚胎成纤维细胞（称为Pfa1细胞）GPX4缺失，然后进行天然维生素化合物筛选，发现除了维生素E最强的生物活性形式α-生育酚(α-TOH)外，只有三种形式的维生素K【叶绿醌（PK），甲基萘醌-4（MK4）和甲基萘醌（menad）】可以帮助细胞抵抗Gpx4缺失诱导的铁死亡，这种抑制作用在人的癌细胞中也有效。
研究人员又使用其他已知铁死亡诱导剂（包括GPX4抑制RSL3）诱导细胞，维生素K对这些诱导剂诱导的铁死亡也有抑制作用。
脂质过氧化是铁死亡的重要特征，作者通过检验细胞的脂质过氧化水平验证了维生素K族化合物可以通过来抑制脂质过氧化从而抑制铁死亡。
然后，研究人员使用GPX4基因遗传缺失的小鼠和病理模型测试维生素K是否也能在体内预防铁死亡。
由于MK4是最有效的衍生物，作者集中于此进行研究。
研究人员使用他莫昔芬诱导小鼠肝细胞敲除GPX4，然后用维生素K （MK4）处理，肝细胞特异性GPX4敲除小鼠在治疗后不久因广泛的肝坏死而死亡，用MK4能够延长小鼠的生存时间，并对肝细胞的病理，凋亡，铁死亡以及脂质氧化均有显著的抑制作用。
除了诱导敲除GPX4，还用了其他类似RSL3和Erastin等诱导的铁死亡，也能被MK4所抑制。
动物实验，也说明了维生素K之一的MK4，能有效抑制缺血再灌注过程中造成的铁死亡。
因此，研究人员得出结论：在相关的铁死亡体内模型中，药理学剂量的维生素K具有有效的抗铁死亡作用，可防止细胞死亡。
（2）FSP1通过维持维生素K还原形态（VKH2）作为自由基捕获剂发挥抗氧化作用
维生素K是一种具有氧化还原活性的萘醌，在已知的维生素K循环中转化为相应的氢醌 (VKH2)。据报道，VKH2是一种有效的RTA，除了作为 γ-谷氨酰羧化酶 (GGCX) 的辅助因子外，还可以防止脂质过氧化。
VK到VKH2需要有VKOR的催化，VKOR会被华法林（Warfarin）抑制。
华法林（Warfarin）是双香豆素衍生物，主要通过抑制维生素K环氧化物还原酶的活性来阻断维生素K的循环，减少VKH2的形成，进而影响维生素K-依赖凝血因子谷氨酰基的γ-羧化反应，导致凝血因子只能停留在没有生物活性的前体状态，最终导致机体凝血障碍。
这个时候，会有另一条非经典的通过NAD(P)H依赖的通路，将VK转化为VKH2，这个酶就是铁死亡抑制蛋白1（Ferroptosis suppressor protein 1, FSP1）。
FSP1(由AIFM2基因编码)是一种依赖于NAD(P)H的泛醌氧化还原酶，，是控制铁死亡的主要方式，通过催化泛醌还原为其氢醌形式消耗NAD(P)H，独立于GPX4发挥作用。
由于维生素K和泛醌具有相同的结构特性，研究进一步探究了FSP1是否可以作为维生素K还原酶，产生VKH2来抑制脂质过氧化。
他们使用重组人FSP1(recombinant human Fsp1)进行体外试验，当三种维生素K形式中的任何一种与rhFSP1和NADH共同孵育时，NADH被消耗，同时质谱结果显示MK4与rhFSP1和NADH共同孵育时会生成还原型维生素K，表明FSP1催化了维生素K的还原。
研究者通过fluorescence-enabled inhibited autoxidation assay(FENIX，荧光激活的抑制性自氧化测试)技术来研究维生素K对氧化脂质的还原能力，以及FSP1在其中的作用。
实验发现虽然叶绿醌、MK4和甲萘醌不能起到直接抑制脂质过氧化的作用，但在rhFSP1和NADH存在的情况下，三种形式的维生素K均能够有效抑制脂质过氧化。NADH本身不抑制脂质过氧化，但NADH的供应可通过FSP1延长三种维生素K对脂质过氧化的抑制时间。
（3）维生素K通过FSP1阻断铁死亡
研究人员进一步通过敲除细胞FSP1基因，发现PK和MK4对RSL3引起的铁死亡抑制作用明显减弱；FSP1表达的重建恢复了PK和MK4的抗铁死亡作用。
这证明了维生素K在发挥铁死亡抑制作用时需要FSP1的协助，GPX4和FSP1 双敲除的细胞需要比GPX4单敲除的细胞需要更高浓度的PK和MK4来预防铁死亡也证明了这一点。
研究者通过添加FSP1的抑制药物和华法林，来检验维生素K的铁死亡抑制作用，实验结果也证明通过抑制FSP1或敲除FSP1都会削弱维生素K对铁死亡的抑制作用，而华法林对FSP1发挥作用没有影响。
这些发现表明，FSP1参与维生素K的还原是PK和MK4抗铁死亡的原因。
然而，在FSP1抑制表达的细胞中，高剂量的PK和MK4仍然可以抑制铁死亡，这表明还有其他机制导致维生素K的转化。
（4）FSP1可避免华法林中毒
维生素K循环的通路中，华法林（Warfarin）是一种VKOR抑制剂。也就是说华法林阻断了维生素K后，会影响GGCX，引起血管破裂，一般这种情况下，会让患者补充大量维生素K。
由于FSP1是VK循环中促进VKH2的另一种激活途径。研究者验证FSP1是否在经典的GGCX–VKOR途径之外存在抗华法林的非经典维生素还原途径起作用。
在使用华法林后，加入rhFSP1，能促进VKH2的量。也就是说FSP1是另一条不能被华法林抑制的维生素K循环途径。
体内实验也证明了，FSP1能抑制华法林毒性。
在华法林抑制VK循环的情况下，FSP1和VKH2能激活整个VK循环，抑制华法林毒性。同时，激活了VK循环，通过GGCX抑制脂质过氧化，从而抑制铁死亡。
