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培养基质量检测细则

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1目的 
为了确保微生物检测质量,需对使用的培养基进行鉴定。保证用原料配制或干粉成品培养基的质量符合质量指标的要求。
2范围
适用于新购进的干粉培养基和实验室用原料配制的固体和液体培养基的性能测试方法。
3职责
3.1培养基验收人员负责用本方法对培养基进行检则验收。
3.2科室负责人负责对培养基进行综合管理。
4器材与检测设备  
4.1玻璃器材   12×100灭菌试管,10mL、5mL、1ml灭菌吸管和培养皿250mL三角烧瓶;250 mL灭菌广口瓶,L棒。
4.2灭菌生理盐水
4.3培养基:参考培养基   待检测培养基;
4.4检测仪器 :分光光度计,恒温培养箱,恒温水浴箱;
4.5参考菌种:大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌50013、福氏志贺氏菌2a ATCC12022、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228溶血性链球菌23310、铜绿假单胞菌10211、小肠耶森氏菌ATCC 23715 、单核增生李斯特菌ATCC19111、 枯草芽胞杆菌ATCC6633b 、蜡状芽胞杆菌ATCC11778、
白色念珠菌ATCC10231、酿酒酵母ATCC9763、黑曲霉ATCC16404b   
5检测步骤
5.1营养琼脂质量检测试验操作规程
5.1.1工作菌株的制备: 将储备的标准菌株,如大肠杆菌ATCC 25922接种到琼脂斜面或平板,36±1℃,孵育过夜,得到足够的纯培养物。孵育后取3~5个单个菌落悬浮于少量TSB中,孵育4~5h,用分光光度计在625nm波长下调整吸光度值为0.08~0.1,
确保菌落计数达到(1~2)×108CFU/mL。
也可以按下列方法配制目视比浊标准管:称取氯化钡0.244g,溶于100mL纯水中。分别吸取1.1、1.2、1.3、1.5mL ,每管各加1moL硫酸5mL,再加水至25mL,在625nm波长下调整吸光度为0.060、0.080、0.100、0.120  4个不同的浊度。分别装在12×100mm的试管中,每管4-5mL,加橡皮塞并用石蜡封口。用无菌盐水从斜面上洗下菌苔,在同样口径的试管中与标准管比对,加盐水调节至0.08标准浊度管相似。即相当于0.5麦氏单位。
5.1.2培养基的制备
0.5麦氏单位各种细菌的数量
金黄色葡萄球菌 8×108/mL
痢疾志贺氏菌 8×108/mL
大肠埃希氏菌 8×108/mL
福氏志贺氏菌 8×108/mL
铜绿假单胞菌 10×108/mL
宋内氏志贺氏菌 8×108/mL
甲型副伤寒沙门氏菌 10×108/mL
甲型溶血性链球菌 2×108/mL
乙型副伤寒沙门氏菌 10×108/mL
霍乱弧菌 18×108/mL
伤寒沙门氏菌 10×108/mL
EL-Tor O1群霍乱弧菌 18×108/mL
5.1.2培养基的制备
选择能够代表一批培养基的适当数量的平板进行测试,每个平板用大约15mL培养基,使得培养基厚度至少为2mm,并保证平板表面足够干燥。用同样方法制备参考培养基。由于使用了大肠杆菌ATCC 25922作为测试菌株,因此这里选择伊红美兰培养基作为参考培养基。
5.1.3将工作菌株悬液10倍梯度稀释,以10-5,10-6,10-7稀释度涂布于平板。每个稀释度分别均匀涂布2个待测成品营养琼脂平板和2个伊红美兰平板,每个平板的接种量为0.1mL。于36±1℃,培养24h。
5.1.4计算每一平板的菌落数,评价菌落的大小和表面特征。
5.1.5结果解释
根据平板上菌液的体积和稀释倍数,计算出培养基上菌落平均值。
  计算生长率PR
                      NS
                 PR= ——
                      NO



1楼2009-11-01 01:34回复
     NS——从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数;
    NO——从一个或多个规定的参考培养基平板上得到的菌落总数(该菌落总数应≥100CFU)。
    选择因子SF的计算:  SF = DO - DS
    DO:能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度。
    DS:能在测试培养基上显示生长的最高稀释度。
    非选择性培养培养基上目标菌的生长率最低应为0.7; 
    选择性培养培养基上目标菌的生长率最低应为0.1;非目标菌在选择性培养培养基上的SF 至少为2。
    PR值在此范围内并结合其它理化性状,综合判定.
    5.2选择性培养基质量鉴定
    5.2.1按GB/T4789.28-2003配制以下参考培养基和待检测培养基:
    SS          200mL               EMB        200mL
    BS          200mL               HE         200mL
    TCBS        200mL              
     待检测培养基各200 mL
    5.2.2工作菌悬液的制备:按5.1.1工作菌液的制备方法制备。
    5.2.3检测方法
    5.2.3.1倾倒平板,每只15mL左右,约3mm厚度, 200 mL共倒12只,使用前烘干表面水份
    5.2.3.2各类选择性培养基取相对应的菌株为目标菌,制成菌悬液(5.2.2),如: BS、HE、SS—— 鼠伤寒沙门氏  TSA-YE——单核增生李斯特菌EMB、SS——福氏志贺氏菌   CIN-1——小肠结肠炎耶尔森氏菌   TCBS——副溶血性弧菌      Baird-Parker琼脂——金黄色葡萄球菌
    5.2.3.3菌液稀释:取7只12×100灭菌试管,每管加灭菌盐水4.50ml
    5.2.3.4混合菌液:目标菌菌悬液0.50mL,大肠杆菌菌悬液0.5 mL表皮葡萄球菌悬液0.5 mL蜡状芽胞杆菌菌悬液0.50 mL,加无菌盐水至5.0mL,混匀后吸取0.50mL加入上面4.50mL盐水中,作10倍递增稀释到10-7,目标菌与非目标菌之比为1/4。 
    5.2.3.5平板接种:各平板加各对应的10-5、10-6、10-7混合菌液0.10mL,用无菌L棒涂布
    均匀,每个稀释度接种2个。同时接种参比培养基每个稀释度接种2个。36±1℃培养24h±2h。
    5.3半定量测试方法(改进的平板划线法)
    该方法适用于固体和液体培养基的性能测试,但仅能是单一目标菌在固体培养基上的补充测试。
    5.3.1按5.1.1和5.2.3.4 的方法制备工作菌株菌液,菌液不作稀释,浓度为108。
    5.3.2用3mm接种环按图划线平板,A、B、C部分用接种环按0.5cm的间隔各划4条
    平行线,最后在D区内划一条连续的曲线。划线时可将模板放在平板下面。
    5.3.2.3按标准规定的培养条件培养平板。
    5.3.2.4计算生长指数G :
    按4个区域菌落生长情况记分:每条有菌落生长的划线作1分。有一半的线条或密集菌落生长记0.5分。生长划线不足一半,不记分。Ⅳ区2根相交的线条作1条,划线上有20个以上的菌落记0.5分,不足20个菌落不记分。
    5.3.2.5结果解释:
    生长指数G值大于6时,培养基可接收。非选择性培养基的G值通常较高。
    在选择性培养基上,目标菌应呈现典型的菌落,而非目标菌的生长应部分或完全被抑制
    图 改进的平板划线法接种模式图
    5.4定性测试方法(平板接种观察法)作为固体培养基性能测试的补充
    


    2楼2009-11-01 01:34
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      2026-05-02 12:08:38
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      5.4.1常规划线法
      5.4.1.1按5.1.1或5.2.3.4的方法制备工作菌株菌液。目标菌的浓度10-6非目标菌10-4
      5.4.1.2用3mm接种环取细菌培养物,在测试培养基表面作规范划线分离。同时在一个平板上接种多个菌株的混合物,但目标菌只能一种,而且目标菌必须容易和非目标菌相区别。
      5.4.1.3在36±1℃,培养24h±2 h。
      5.4.1.4 结果解释:
      ○1分别统计目标菌和非目标菌的菌落数,并计算比值,目标菌的比值达到0.2或有20个以上目标菌,并有典型的菌落外观、大小和形态。
      ○2观察培养基上的菌落大小:鼠伤寒沙门氏菌,福氏志贺氏的菌落直径应在2.6-3.0mm以上;副溶血性弧菌菌落在3.1-4.2mm以上;大肠杆菌的菌落直径应在2.6-3.3mm以上;金黄色葡萄球菌的菌落直径应在1.5-2.3mm以上, 非目标菌的生长应部分或全部被抑制。符合以上要求的培养基可以接受
      5.4.2多个菌液平行划线法
      5.4.2.1按5.1.1或5.2.3.4的方法制备工作菌液。                 
      目标菌的浓度10-6 ,非目标菌10-4。
      5.4.2.2用3mm接种环分别取目标菌液和各种非目标菌
      培养物放在培养基的左面一端,接种环贴在培养基的表
      面向另一端拉一条较宽的线条。在测试的选择性平板培
      养基表面可接种多个非目标菌的平行线条,每一个细菌
      只划一条长线条,每线条相距1cm.目标菌在最中央,非目
      标菌在目标菌的两边,相互之刘不可交叉,记录各细菌的
      序号位置。
      5.4.2.3在36±1℃,培养24h±2 h。                            样图
      5.4.2.4 结果解释:目标菌长出一条完整的直线,非目标菌应部分或全部被抑制。根据长出细菌的强弱状态来确认培养基的选择性能。
      5.4液体培养基测试方法
      5.4.1测试步骤
      5.4.1.1按5.1.1 的方法制备工作菌株菌液。
      5.4.1.2从每批液体培养基中选择适当数量的试管或每份10mL的培养基进行测试。
      5.4.1.3接种目标菌:按每管10CFU~100CFU接种测试肉汤和参考肉汤,混匀。
      5.4.1.4接种非目标菌:按每管大于1000CFU接种测试肉汤和参考肉汤,混匀。
      5.4.1.5接种目标菌和非目标菌混合培养物:目标菌按每管10CFU~100CFU接种于测试肉汤和参考肉汤,同时在选择性液体培养基每个试管中接种大于1000-10000CFU的非目标菌,混匀。
      5.4.1.6按标准规定的培养条件对接种后的试管进行培养。
      5.4.1.7培养后,从每一种肉汤中移取一定量的菌液,必要时按4.2.2.1稀释至所需的稀释度,按5.2.3.5定量测试方法(Miles-Misra法)涂布于非抑制性琼脂平板上,同时涂布于在对应的选择性平板 ,按标准规定的培养条件对平板培养后进行计算。
      5.4.2结果解释:培养后,对目标菌和非目标菌进行计数,以区分不同的培养基。并根据不同的测试目的,进行计算和解释。
      5.4.2.1 按PR值对参考肉汤和测试肉汤进行比较和解释。目标菌的PR值不应小于0.1(测
      试培养基与参考培养基菌落总数的差别不超过一个数量级);混合菌中,目标菌株的生长不应受到非目标菌生长的抑制,即目标菌始终应为优势菌。
      5.4.2.2在混合菌中目标菌数量的最低值及非目标菌的最高值应符合以下要求:
      目标菌的最低浓度和非目标菌的最高值应达到106CFU/mL~108CFU/mL;
      5.5含胆盐的乳糖发酵管和不含胆盐的乳糖发酵管
      5.5.1试验菌液大肠杆菌ATCC 25922菌液
      5.5.2乳糖发酵管6支,自10-6、10-7、10-8各接种菌液0.10mL,每个稀释度接种2管。
      5.5.3 培养:36±1℃培养24h±2h,在规定时间内应产酸产气。
      


      3楼2009-11-01 01:34
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        • 119.33.103.*
        回复:4楼
        好东东,多谢了!


        5楼2010-01-25 23:01
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          • 60.190.49.*
          帮助甚大 多谢


          6楼2010-03-23 10:21
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            太感谢了,我要写一个麦康凯的检测标准,不知道根据什么写,这下好了,可以参考一下》


            8楼2011-07-27 09:12
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              挺有用的 多发表些


              9楼2011-12-16 14:36
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                网上一搜就搜到吕老师的检测细则,受益~


                IP属地:广东10楼2012-06-28 15:41
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