看下面的两个蛋白电泳图，感觉应该是表达出了目的蛋白，但是用pet28a，N端加His，在BL21DE3中表达，表达出来的蛋白应该是8KDa左右，但是跑出来的条带在10到15KDa之间，这有些奇怪。
我进行了蛋白提纯也提纯了出来如图第4.5.6.7是收集的洗脱蛋白，1是沉淀，2是上清，3是结合蛋白后的Wash buffer
但是做了很多遍的Western blot 都没有做出条带，抗体用的是一抗和二抗预结合的，抗体什么的应该没有问题（同学和我一起做的做出来了）
一开始用400mA跑35min转膜，没转出来，以为是透膜了，后来用300mA跑30min，100mA跑60min都没跑出来，不知道是不是转膜条件的问题。
0.45的NC膜和0.22的PVED膜都做了没做出来，以为蛋白降解了所以重新做了新的样品，但是还是没有转出来。
所以我想问一下！
1.我在N端加的His标签，载体是pet28a，是不是因为N端的氨基酸比较容易降解，所以Western blot做不出来，是不是C端加上HIS标签会比较好做出western blot，
2.是不是我的转膜电流，时间的问题，
3.是不是蛋白质透膜问题
4.我跑的15%的胶，跑到差不多底部，溴酚蓝还有0.4CM左右要跑出胶，先跑75v，25min，再135V，50min，是不是跑电泳的问题
5.是不是我的蛋白没表达出来
6.我纯化的蛋白为什么杂带那么多，用的250mM咪唑配的洗脱液
这个是不同IPTG浓度的，2.3是对照，后面的是不同的IPTG浓度，第4道是没有IPTG的
这个是不同时间的前面2，3分别是空载体没诱导和诱导的对照，4，5，6，7，8，9是0.2.4.6.8.10小时的有目的条带
4.5.6.7是收集的洗脱蛋白，1是沉淀，2是上清，3是结合蛋白后的Wash buffer
我进行了蛋白提纯也提纯了出来如图第4.5.6.7是收集的洗脱蛋白，1是沉淀，2是上清，3是结合蛋白后的Wash buffer
但是做了很多遍的Western blot 都没有做出条带，抗体用的是一抗和二抗预结合的，抗体什么的应该没有问题（同学和我一起做的做出来了）
一开始用400mA跑35min转膜，没转出来，以为是透膜了，后来用300mA跑30min，100mA跑60min都没跑出来，不知道是不是转膜条件的问题。
0.45的NC膜和0.22的PVED膜都做了没做出来，以为蛋白降解了所以重新做了新的样品，但是还是没有转出来。
所以我想问一下！
1.我在N端加的His标签，载体是pet28a，是不是因为N端的氨基酸比较容易降解，所以Western blot做不出来，是不是C端加上HIS标签会比较好做出western blot，
2.是不是我的转膜电流，时间的问题，
3.是不是蛋白质透膜问题
4.我跑的15%的胶，跑到差不多底部，溴酚蓝还有0.4CM左右要跑出胶，先跑75v，25min，再135V，50min，是不是跑电泳的问题
5.是不是我的蛋白没表达出来
6.我纯化的蛋白为什么杂带那么多，用的250mM咪唑配的洗脱液
这个是不同IPTG浓度的，2.3是对照，后面的是不同的IPTG浓度，第4道是没有IPTG的
这个是不同时间的前面2，3分别是空载体没诱导和诱导的对照，4，5，6，7，8，9是0.2.4.6.8.10小时的有目的条带
4.5.6.7是收集的洗脱蛋白，1是沉淀，2是上清，3是结合蛋白后的Wash buffer
