结果与讨论
3.1 。 HS-SPME法的优化
是首选的第一无效尿液样本，因为它们展示
一些生活方式的因素相比，影响较小
点尿样品。这些生活方式的因素可以作为
混杂因素在代谢组学分析[ 38 ] 。如
有机挥发物呈现出宽的浓度范围
和物理化学特性，效率
提取的依赖于该方法
用[39] 。在这项工作中，我们评估的影响
pH值，纤维涂层等因素的影响，加入盐，提取
温度（文本） ，提取时间（文字）和孵化
时间（ TINC ）影响的HS-SPME和
确定了最佳条件，其中包括那些研究，
基于总反应区的意思是和再现性
（CV％）各组条件下获得的。该
色谱图进行降噪和
表2
因素，水平和条件的实验领域应用
顶空固相微萃取（ HSSPME ）优化了提取。
变量变量编码
？ AA ？ 1 0 1 + AA
氯化钠（G ） 0 0.4 0.8 1.2 1.6
孵育时间（ TINC ，分钟） 0 5 10 15 20
提取时间（文字，分钟） 15 30 45 60 75
提取温度（T ， ℃） 30 40 50 60 70
A A = 2.000 。
4 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX
请引用本文按为：蒙泰罗M.等，挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 -
质谱生物标志物的发现：在应用试点研究与肾细胞癌，欧元J癌症（ 2014年） ，包含http://歧视患者
dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011
只有比强度的三倍更高的山峰
信号与噪声的比值，记录峰值的整合。
三个pH值（酸性，生理和基本）和
五种类型的固相微萃取纤维（ 50/30流明二乙烯基苯/
carboxen /聚二甲基硅氧烷（ DVB / CAR / PDMS）
65流明二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷（ DVB /
PDMS ） ， 100流明聚二甲基硅氧烷（ PDMS ） ， 7流明
PDMS和85流明聚丙烯酸酯（ PA） ）进行了研究，
优化了提取条件。此外，一个
响应面实验设计成立
调查的其他四个因素的影响;加入盐，
提取温度（文本） ，提取时间（文字）和
孵育时间（ TINC ） ，以达到最佳的
分析性能。
3.1.1 。 pH值的选择
它是众所周知的，尿呈现出高度的个体
和个体内变异性[ 40〜43] ，这
可能会影响负面结果的解释
引入额外的偏置。此外，样品的pH值
极大地干扰了基本的电离状态
与酸性化合物和HSSPME的效率
提取是由它的存在增强了他们的
中性形式[ 44 ] 。因此，样品的pH值是非常重要的
参数优化时予以考虑。
一个HS-SPME过程。图。图1示出的结果
所测试的各pH值获得的平均总面积
对于自己的能力来提取挥发性代谢组学
简介人体尿液中。的提取条件
是相同的相对于所述均衡和
提取时间，温度，顶空体积和
量的试样，并在所获得的区域的差异
是仅依赖于样品的pH值。基于
这些结果，作为酸性pH值（ pH值= 2）是一个与
较高的平均总面积响应值，其被选择
作为最佳提取pH值对代谢组学
分析尿液样本。事实上，仅仅基于所述
总面积响应值，有人认为这
是代表更高的金额化合物
提取。此外，根据峰值复杂
色谱图如图所示。 2 ，在酸性pH值
似乎有收集挥发最佳容量
人尿样品中的内容。然而，它会
是重要的，有条件的，就是在酸性pH值的提取
酸性化合物主要是看好了
基本的，这并不意味着酸性代谢
作为癌症生物标志物更重要。
一些化合物在尿中作为偶联物消除，
其中，由于其较高的分子量，并
在一般情况下，较高的亲水性[45]，往往不太
波动。因此，使用在酸性pH值可提高
这种化合物在其非共轭量
形式和额外的挥发性化合物的释放
从而获得更高的总响应区域。事实上，
了类似的结论，从最近的一项研究得出
其中天然人尿样和人尿
通过酶解处理，以进行分析
向这些样品中的加臭剂的特征。在
处理过的尿液样本有被确定气味更
当比较化合物（总共35化合物）
与未经处理的样品（仅20个化合物） [ 46 ] 。我们的
结果与那些罗恰达成协议
等。 （2012）示出了使用酸性pH值的
（ pH值2.0 ）允许一个更好的HS-SPME萃取
人尿样品，无论是在化合物的总量而言
总的GC ？气相色谱峰
区域，相对于生理pH （5.8）和较高
pH值（12.0） [29]。然而，强酸性条件下
也可能引入一些错误，因为一些非共轭
和pH敏感的化合物可进行化学
降解。然而，由于健康和癌症样品
也同样处理，任何化学退化
可能会出现由于酸性pH值会在这两个被认为是
类型的样品。
3.1.2 。光纤涂料的选择
固相微萃取纤维的选择是正确的特别
的重要性，尤其是在不相关的代谢组学实验
其目的是要覆盖最大可能的
量的代谢产物（具有不同浓度
范围和理化性质），在这种情况下，
各样品的挥发性代谢。
对于该测定， 5纤维（DVB / CAR / PDMS ，DVB /
PDMS ， PDMS 100流明， PDMS 7 LM和PA ）分别为
测试它们的提取效率。的整体性能
根据总的各纤维，评价
平均峰面积的和可再现性。图。图3示出了
结果每个固相微萃取纤维获得的总平均面积
对于自己的能力，提取挥发测试
部分汇集人尿。由于每根纤维
在相同条件下暴露于顶部空间
图。三个层次的pH值对提取的效率1 。影响
汇集来自人尿挥发性化合物采用顶空固
固相微萃取（ HS-SPME ） 。结果呈现为平均值
获得的气相色谱 - 总响应区域的一式三份的值
离子阱/质谱法（ GC-IT/MS ）色谱图
和标准偏差。
M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX 5
请引用本文按为：蒙泰罗M.等，挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 -
质谱生物标志物的发现：在应用试点研究与肾细胞癌，欧元J癌症（ 2014年） ，包含http://歧视患者
dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011
的平衡时间，萃取时间和温度，
在所获得的区域中的差异显示提取
在分析中使用的纤维涂层的效率。该
纤维这表明了最高的性能
尿中挥发性代谢产物为DVB / PDMS 。此外，
这种纤维具有较好的重现性比较
符合DVB / CAR / PDMS纤维（另一纤维
混合极性）。对于所有光纤类型的变异系数
（ CV ％ ）为低，用于DVB / PDMS分别为2.16 ％ ，
用于DVB / CAR / PDMS 12.09 ％ ，为100流明8.90 ％
PDMS ， 5.37％为PA和7流明的PDMS 1.00 ％ 。
3.1.3 。实验条件的优化
几种因素可以提高提取效率
通过促进挥发物从液体转移
（尿），以气相（顶部空间） 。在那些之中，
我们选择的含盐量，提取时间，
孵化温度和提取测试时间
和优化方法。使用的实验水平
每个因素都按照既定的
文献资料[ 28,29,32,33 ] 。 CCD作为一种实验
为了评估优化设计方法
影响HS-SPME每个参数的值（水平）
优化过程的响应。这种方法
图。 2，提取人体尿液挥发物的代表总离子色谱图，用的是50/30流明二乙烯基苯/ carboxen /聚二甲基硅氧烷
（ DVB / CAR / PDMS ）固相微萃取（SPME ）纤维，在三个不同的pH值：酸性（ 1-2） ，生理（ 5-6 ）和碱性（ 9-10） 。
图。固相微萃取（SPME ）纤维3 。效率
在从收集的挥发性化合物的提取涂层
人体尿液样品采用顶空固相微萃取（ HS-SPME ） 。结果
提出的总响应领域的一式三份的平均值
获得的气相色谱 - 离子阱/质谱法（GC -IT /
MS）的色谱图和标准偏差。
6 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX
请引用本文按为：蒙泰罗M.等，挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 -
质谱生物标志物的发现：在应用试点研究与肾细胞癌，欧元J癌症（ 2014年） ，包含http://歧视患者
dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011
使能，同时，个人的评价
每个变量的响应的意义，在这种情况
在HS- SPME尿挥发性代谢物，并且还
的相关性在他们之中。这样的应用
统计优化程序类型是有利
在单变量方法在可能的影响
是不是采取了重要的变量之间的相互作用
考虑。此外，这种类型的策略允许
的最佳条件与更少的决心
实验数[ 47 ] 。虽然CCD ，多元
分析，先前被用在其它基质，
即在食品饮料[48,49] ，据我们所知，这
是第一次，它被应用到尿液样本。在这种
试验中， 29次试验随机地执行与
响应值（总面积）列于表3中。
帕累托图（图4）是用来说明的贡献
每个因子的提取效率。这
图表包含一个酒吧为每个因素包括与
它们的组合，排序，从最显著到
的至少一个。在图表绘制一条垂直线
定义了学生t -检验的临界值。任何因素
或者是由条表示因素组合
延伸到临界值的右侧被认为是
为响应（提取效率）显著。
在我们的研究中，95％的显着性水平被认为是
因此，临界值设定为0.05 。正棒的
分数定义了因子和之间有直接的关系
输出响应，即认为增加值
那因素导致一个增强的响应。在
另一方面，负分限定的反比关系
之间的因子的水平和响应。
考虑到所得帕累托图，温度
提取[ （ 4 ） T（ L） ]是最积极的，
对于挥发性轮廓的提取显著因子
从人的尿液样本由HS-SPME ，其次是
提取时间[（3 ）纤度（ L）] ，并加入盐[ （1）的NaCl
（L）] 。当中的因素进行评估，孵化效果
时间[（2 ）锡（L）]是不为实验显著
自治领成立（即培养时间
包含在优化的值）。此外，还有
是时间之间的正，虽然轻微，互动
和提取（ 3Lby4L ）的温度。理想情况下，该
培养和提取时间应使分区
化合物的达到平衡[ 50]
表3
为响应（总面积）的实验条件和值获得的用于中心复合设计（ CCD ）
的提取条件，由人尿的顶空固相微萃取（ HS-SPME ）的优化。
实验号实验条件
氯化钠（ G） TINC （分钟）文本（分钟）乙T（ ℃） C响应（总aread ）
1 0.8 10 45 30 5.3238E +10
2 0.4 5 30 40 9.1059E +10
3 1.2 5 30 40 5.3263E +10
4 0.4 15 30 40 1.4738E +11
5 1.2 15 30 40 4.4111E +10
6 0.4 5 60 40 9.8210E +10
7 1.2 5 60 40 7.6369E +10
8 0.4 15 60 40 1.4902E +11
9 1.2 15 60 40 7.1890E +10
10 0.8 10 15 50 1.3624E +11
11 0.8 0 45 50 8.5103E +10
12 0.0 10 45 50 1.9914E +11
13 0.8 10 45 50 6.0851E +10
14 0.8 10 45 50 1.3204E +11
15 0.8 10 45 50 1.0604E +11
16 0.8 10 45 50 2.0893E +11
17 0.8 10 45 50 3.8581E +10
18 1.6 10 45 50 1.0386E +11
19 0.8 20 45 50 1.1963E +11
20 0.8 10 75 50 1.2023E +11
21 0.4 5 30 60 5.7463E +10
22 1.2 5 30 60 1.5521E +11
23 0.4 15 30 60 7.0845E +10
24 1.2 15 30 60 3.0427E +11
25 0.4 5 60 60 1.2855E +11
26 1.2 5 60 60 1.1115E +11
27 0.4 15 60 60 1.2827E +11
28 1.2 15 60 60 1.2239E +11
29 0.8 10 45 70 1.4940E +11
一个TINC - 培养时间。
乙文 - 提取时间。
C T - 提取和培养温度。
任意单位d总面积表示。
M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX 7
请引用本文按为：蒙泰罗M.等，挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 -
质谱生物标志物的发现：在应用试点研究与肾细胞癌，欧元J癌症（ 2014年） ，包含http://歧视患者
dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011
并且，在一般情况下，在搅拌和加热倾向于
减少所需要的时间，特别是对于低挥发性
化合物。与此相反，在吸附
由纤维化合物倾向于降低与更高
的温度，这限制了化合物的量
提取[ 16 ] 。此外，使用高的温度时，
不耐热的代谢产物降解的风险
需要考虑的一个重要的变量
在结果的解释。事实上，使用较高
温度，我们可以提高我们的富集
挥发性提取物具有低挥发性代谢产物，并在
同一时间，导致更不耐热的降解
的，从而导致他们的损失及外观
降解产物。的加成盐是频繁
用于挥发性物质的提取，由于提取
“盐析”作用，从而提高分析物的量
进入顶部空间，并随后进入纤维
涂料[ 50 ] 。图。图5A和B显示响应面
P = .05
标准化的效应估计值（绝对值）
1Lby2L
2Lby4L
（2）锡（L）
1Lby3L
2Lby3L
锡（Q）的
1Lby4L
3Lby4L
特（ Q）的
T（ Q）
氯化钠（Q）的
（1）氯化钠（ L）的
（3）纤度（ L）的
（4）T （ L）的
15.82
7.82
6.14
-6.06
4.59
-2.84
2.81
1.69
-1.60
1.31
1.06
0.58
-0.17
-0.13
图。 4，帕累托图的24析因设计总色谱峰面积（锡标准化的作用 - 培养时间（ 2 ） ，特克斯 - 萃取时间
（3）;笔 - 萃取温度和（ 4 ）氯化钠（ 1 ） ） 。 （L）和（Q）的平均线性和二次效应，分别。 y轴包括所有的变量
该研究（隔离）和它们的可能组合及其对学习效果的优化将其X轴记者描述
显着性值。
图。 5，响应面获得通过中心组合设计条件的优化： （一）提取温度（ ？ T， C）和
提取时间（文字， min）和提取（B）的温度（T ， ℃）和NaCl的含量（g ） ，对于挥发性轮廓从尿中提取
样品顶空固相微萃取（ HS-SPME ） 。响应是每组下得到的总色谱峰面积
条件。
8 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX
请引用本文按为：蒙泰罗M.等，挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 -
质谱生物标志物的发现：在应用试点研究与肾细胞癌，欧元J癌症（ 2014年） ，包含http://歧视患者
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在CCD获得的模型。根据计算结果，
整体最优值和萃取条件，
所研究的范围内，则有：培养时间
9分钟， 24分钟提取一次，0.59克盐加
和提取在68 ？ C。
3.2 。挥发性配置文件作为判别工具
证明该挥发性轮廓可以是概念
在尿液从RCC患者的歧视使用
和健康对照组，无监督统计方法
（PCA ）是适用。所得到的结果示于
图。 6，尽管在高的个体差异
泌尿访问，特别是在控制
组，而事实上，这组变量只能
解释的变异的60.33 ％的第2间
主成分（ PC1和PC2 ） ，这些探索
结果仍然看好。
4，结束语
可能使用的挥发性尿轮廓来
鉴别病理条件下有报道，
至少，自1971年[ 51 ] 。这些作品极大地凸显
尿液的挥发性仿形因为它避免了潜在的
一些与GC / MS分析尿液分析相关的挑战
[38] 。然而，考虑到HSSPME的高灵敏度
到可能影响实验条件
的分布和吸收/吸附率
化合物中，关键的是要优化和控制那些
在提取过程中的实验变量。
在这里，我们描述了开发和优化
的HS-SPME方法对尿分析
人体代谢。本研究的主要优点
是使用一种实验设计，使之
研究多个变量同时作用。
在加上一个中央特别设计的阶乘
复合设计（ CCD）的一些优化
参数是已知的干扰的提取
效率，因为CCD能使之间可能的相互作用研究
他们之间。结果表明， pH值，
光纤涂料和提取温度的强烈影响
总色谱峰面积。最佳
提取条件为挥发人类的分析
尿代谢被认为是：酸性pH值（2） ，
DVB / PDMS纤维涂层，另外0.59克氯化钠，
培养和提取在68 ？的C期间9分钟
24分钟。
在开发和优化HS-SPME法是
在患病之间（ RCC）的歧视待遇
和正常的尿液样本，显示希望的结果
这将在不久的将来进行探讨，以提高其
适用性。
3.1 。 HS-SPME法的优化
是首选的第一无效尿液样本，因为它们展示
一些生活方式的因素相比，影响较小
点尿样品。这些生活方式的因素可以作为
混杂因素在代谢组学分析[ 38 ] 。如
有机挥发物呈现出宽的浓度范围
和物理化学特性，效率
提取的依赖于该方法
用[39] 。在这项工作中，我们评估的影响
pH值，纤维涂层等因素的影响，加入盐，提取
温度（文本） ，提取时间（文字）和孵化
时间（ TINC ）影响的HS-SPME和
确定了最佳条件，其中包括那些研究，
基于总反应区的意思是和再现性
（CV％）各组条件下获得的。该
色谱图进行降噪和
表2
因素，水平和条件的实验领域应用
顶空固相微萃取（ HSSPME ）优化了提取。
变量变量编码
？ AA ？ 1 0 1 + AA
氯化钠（G ） 0 0.4 0.8 1.2 1.6
孵育时间（ TINC ，分钟） 0 5 10 15 20
提取时间（文字，分钟） 15 30 45 60 75
提取温度（T ， ℃） 30 40 50 60 70
A A = 2.000 。
4 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX
请引用本文按为：蒙泰罗M.等，挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 -
质谱生物标志物的发现：在应用试点研究与肾细胞癌，欧元J癌症（ 2014年） ，包含http://歧视患者
dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011
只有比强度的三倍更高的山峰
信号与噪声的比值，记录峰值的整合。
三个pH值（酸性，生理和基本）和
五种类型的固相微萃取纤维（ 50/30流明二乙烯基苯/
carboxen /聚二甲基硅氧烷（ DVB / CAR / PDMS）
65流明二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷（ DVB /
PDMS ） ， 100流明聚二甲基硅氧烷（ PDMS ） ， 7流明
PDMS和85流明聚丙烯酸酯（ PA） ）进行了研究，
优化了提取条件。此外，一个
响应面实验设计成立
调查的其他四个因素的影响;加入盐，
提取温度（文本） ，提取时间（文字）和
孵育时间（ TINC ） ，以达到最佳的
分析性能。
3.1.1 。 pH值的选择
它是众所周知的，尿呈现出高度的个体
和个体内变异性[ 40〜43] ，这
可能会影响负面结果的解释
引入额外的偏置。此外，样品的pH值
极大地干扰了基本的电离状态
与酸性化合物和HSSPME的效率
提取是由它的存在增强了他们的
中性形式[ 44 ] 。因此，样品的pH值是非常重要的
参数优化时予以考虑。
一个HS-SPME过程。图。图1示出的结果
所测试的各pH值获得的平均总面积
对于自己的能力来提取挥发性代谢组学
简介人体尿液中。的提取条件
是相同的相对于所述均衡和
提取时间，温度，顶空体积和
量的试样，并在所获得的区域的差异
是仅依赖于样品的pH值。基于
这些结果，作为酸性pH值（ pH值= 2）是一个与
较高的平均总面积响应值，其被选择
作为最佳提取pH值对代谢组学
分析尿液样本。事实上，仅仅基于所述
总面积响应值，有人认为这
是代表更高的金额化合物
提取。此外，根据峰值复杂
色谱图如图所示。 2 ，在酸性pH值
似乎有收集挥发最佳容量
人尿样品中的内容。然而，它会
是重要的，有条件的，就是在酸性pH值的提取
酸性化合物主要是看好了
基本的，这并不意味着酸性代谢
作为癌症生物标志物更重要。
一些化合物在尿中作为偶联物消除，
其中，由于其较高的分子量，并
在一般情况下，较高的亲水性[45]，往往不太
波动。因此，使用在酸性pH值可提高
这种化合物在其非共轭量
形式和额外的挥发性化合物的释放
从而获得更高的总响应区域。事实上，
了类似的结论，从最近的一项研究得出
其中天然人尿样和人尿
通过酶解处理，以进行分析
向这些样品中的加臭剂的特征。在
处理过的尿液样本有被确定气味更
当比较化合物（总共35化合物）
与未经处理的样品（仅20个化合物） [ 46 ] 。我们的
结果与那些罗恰达成协议
等。 （2012）示出了使用酸性pH值的
（ pH值2.0 ）允许一个更好的HS-SPME萃取
人尿样品，无论是在化合物的总量而言
总的GC ？气相色谱峰
区域，相对于生理pH （5.8）和较高
pH值（12.0） [29]。然而，强酸性条件下
也可能引入一些错误，因为一些非共轭
和pH敏感的化合物可进行化学
降解。然而，由于健康和癌症样品
也同样处理，任何化学退化
可能会出现由于酸性pH值会在这两个被认为是
类型的样品。
3.1.2 。光纤涂料的选择
固相微萃取纤维的选择是正确的特别
的重要性，尤其是在不相关的代谢组学实验
其目的是要覆盖最大可能的
量的代谢产物（具有不同浓度
范围和理化性质），在这种情况下，
各样品的挥发性代谢。
对于该测定， 5纤维（DVB / CAR / PDMS ，DVB /
PDMS ， PDMS 100流明， PDMS 7 LM和PA ）分别为
测试它们的提取效率。的整体性能
根据总的各纤维，评价
平均峰面积的和可再现性。图。图3示出了
结果每个固相微萃取纤维获得的总平均面积
对于自己的能力，提取挥发测试
部分汇集人尿。由于每根纤维
在相同条件下暴露于顶部空间
图。三个层次的pH值对提取的效率1 。影响
汇集来自人尿挥发性化合物采用顶空固
固相微萃取（ HS-SPME ） 。结果呈现为平均值
获得的气相色谱 - 总响应区域的一式三份的值
离子阱/质谱法（ GC-IT/MS ）色谱图
和标准偏差。
M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX 5
请引用本文按为：蒙泰罗M.等，挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 -
质谱生物标志物的发现：在应用试点研究与肾细胞癌，欧元J癌症（ 2014年） ，包含http://歧视患者
dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011
的平衡时间，萃取时间和温度，
在所获得的区域中的差异显示提取
在分析中使用的纤维涂层的效率。该
纤维这表明了最高的性能
尿中挥发性代谢产物为DVB / PDMS 。此外，
这种纤维具有较好的重现性比较
符合DVB / CAR / PDMS纤维（另一纤维
混合极性）。对于所有光纤类型的变异系数
（ CV ％ ）为低，用于DVB / PDMS分别为2.16 ％ ，
用于DVB / CAR / PDMS 12.09 ％ ，为100流明8.90 ％
PDMS ， 5.37％为PA和7流明的PDMS 1.00 ％ 。
3.1.3 。实验条件的优化
几种因素可以提高提取效率
通过促进挥发物从液体转移
（尿），以气相（顶部空间） 。在那些之中，
我们选择的含盐量，提取时间，
孵化温度和提取测试时间
和优化方法。使用的实验水平
每个因素都按照既定的
文献资料[ 28,29,32,33 ] 。 CCD作为一种实验
为了评估优化设计方法
影响HS-SPME每个参数的值（水平）
优化过程的响应。这种方法
图。 2，提取人体尿液挥发物的代表总离子色谱图，用的是50/30流明二乙烯基苯/ carboxen /聚二甲基硅氧烷
（ DVB / CAR / PDMS ）固相微萃取（SPME ）纤维，在三个不同的pH值：酸性（ 1-2） ，生理（ 5-6 ）和碱性（ 9-10） 。
图。固相微萃取（SPME ）纤维3 。效率
在从收集的挥发性化合物的提取涂层
人体尿液样品采用顶空固相微萃取（ HS-SPME ） 。结果
提出的总响应领域的一式三份的平均值
获得的气相色谱 - 离子阱/质谱法（GC -IT /
MS）的色谱图和标准偏差。
6 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX
请引用本文按为：蒙泰罗M.等，挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 -
质谱生物标志物的发现：在应用试点研究与肾细胞癌，欧元J癌症（ 2014年） ，包含http://歧视患者
dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.04.011
使能，同时，个人的评价
每个变量的响应的意义，在这种情况
在HS- SPME尿挥发性代谢物，并且还
的相关性在他们之中。这样的应用
统计优化程序类型是有利
在单变量方法在可能的影响
是不是采取了重要的变量之间的相互作用
考虑。此外，这种类型的策略允许
的最佳条件与更少的决心
实验数[ 47 ] 。虽然CCD ，多元
分析，先前被用在其它基质，
即在食品饮料[48,49] ，据我们所知，这
是第一次，它被应用到尿液样本。在这种
试验中， 29次试验随机地执行与
响应值（总面积）列于表3中。
帕累托图（图4）是用来说明的贡献
每个因子的提取效率。这
图表包含一个酒吧为每个因素包括与
它们的组合，排序，从最显著到
的至少一个。在图表绘制一条垂直线
定义了学生t -检验的临界值。任何因素
或者是由条表示因素组合
延伸到临界值的右侧被认为是
为响应（提取效率）显著。
在我们的研究中，95％的显着性水平被认为是
因此，临界值设定为0.05 。正棒的
分数定义了因子和之间有直接的关系
输出响应，即认为增加值
那因素导致一个增强的响应。在
另一方面，负分限定的反比关系
之间的因子的水平和响应。
考虑到所得帕累托图，温度
提取[ （ 4 ） T（ L） ]是最积极的，
对于挥发性轮廓的提取显著因子
从人的尿液样本由HS-SPME ，其次是
提取时间[（3 ）纤度（ L）] ，并加入盐[ （1）的NaCl
（L）] 。当中的因素进行评估，孵化效果
时间[（2 ）锡（L）]是不为实验显著
自治领成立（即培养时间
包含在优化的值）。此外，还有
是时间之间的正，虽然轻微，互动
和提取（ 3Lby4L ）的温度。理想情况下，该
培养和提取时间应使分区
化合物的达到平衡[ 50]
表3
为响应（总面积）的实验条件和值获得的用于中心复合设计（ CCD ）
的提取条件，由人尿的顶空固相微萃取（ HS-SPME ）的优化。
实验号实验条件
氯化钠（ G） TINC （分钟）文本（分钟）乙T（ ℃） C响应（总aread ）
1 0.8 10 45 30 5.3238E +10
2 0.4 5 30 40 9.1059E +10
3 1.2 5 30 40 5.3263E +10
4 0.4 15 30 40 1.4738E +11
5 1.2 15 30 40 4.4111E +10
6 0.4 5 60 40 9.8210E +10
7 1.2 5 60 40 7.6369E +10
8 0.4 15 60 40 1.4902E +11
9 1.2 15 60 40 7.1890E +10
10 0.8 10 15 50 1.3624E +11
11 0.8 0 45 50 8.5103E +10
12 0.0 10 45 50 1.9914E +11
13 0.8 10 45 50 6.0851E +10
14 0.8 10 45 50 1.3204E +11
15 0.8 10 45 50 1.0604E +11
16 0.8 10 45 50 2.0893E +11
17 0.8 10 45 50 3.8581E +10
18 1.6 10 45 50 1.0386E +11
19 0.8 20 45 50 1.1963E +11
20 0.8 10 75 50 1.2023E +11
21 0.4 5 30 60 5.7463E +10
22 1.2 5 30 60 1.5521E +11
23 0.4 15 30 60 7.0845E +10
24 1.2 15 30 60 3.0427E +11
25 0.4 5 60 60 1.2855E +11
26 1.2 5 60 60 1.1115E +11
27 0.4 15 60 60 1.2827E +11
28 1.2 15 60 60 1.2239E +11
29 0.8 10 45 70 1.4940E +11
一个TINC - 培养时间。
乙文 - 提取时间。
C T - 提取和培养温度。
任意单位d总面积表示。
M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX 7
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并且，在一般情况下，在搅拌和加热倾向于
减少所需要的时间，特别是对于低挥发性
化合物。与此相反，在吸附
由纤维化合物倾向于降低与更高
的温度，这限制了化合物的量
提取[ 16 ] 。此外，使用高的温度时，
不耐热的代谢产物降解的风险
需要考虑的一个重要的变量
在结果的解释。事实上，使用较高
温度，我们可以提高我们的富集
挥发性提取物具有低挥发性代谢产物，并在
同一时间，导致更不耐热的降解
的，从而导致他们的损失及外观
降解产物。的加成盐是频繁
用于挥发性物质的提取，由于提取
“盐析”作用，从而提高分析物的量
进入顶部空间，并随后进入纤维
涂料[ 50 ] 。图。图5A和B显示响应面
P = .05
标准化的效应估计值（绝对值）
1Lby2L
2Lby4L
（2）锡（L）
1Lby3L
2Lby3L
锡（Q）的
1Lby4L
3Lby4L
特（ Q）的
T（ Q）
氯化钠（Q）的
（1）氯化钠（ L）的
（3）纤度（ L）的
（4）T （ L）的
15.82
7.82
6.14
-6.06
4.59
-2.84
2.81
1.69
-1.60
1.31
1.06
0.58
-0.17
-0.13
图。 4，帕累托图的24析因设计总色谱峰面积（锡标准化的作用 - 培养时间（ 2 ） ，特克斯 - 萃取时间
（3）;笔 - 萃取温度和（ 4 ）氯化钠（ 1 ） ） 。 （L）和（Q）的平均线性和二次效应，分别。 y轴包括所有的变量
该研究（隔离）和它们的可能组合及其对学习效果的优化将其X轴记者描述
显着性值。
图。 5，响应面获得通过中心组合设计条件的优化： （一）提取温度（ ？ T， C）和
提取时间（文字， min）和提取（B）的温度（T ， ℃）和NaCl的含量（g ） ，对于挥发性轮廓从尿中提取
样品顶空固相微萃取（ HS-SPME ） 。响应是每组下得到的总色谱峰面积
条件。
8 M.蒙特罗等人。 /欧洲癌症杂志XXX的（2014 ） XXX-XXX
请引用本文按为：蒙泰罗M.等，挥发性人通过固相微萃取结合尿代谢组分析用气相色谱 -
质谱生物标志物的发现：在应用试点研究与肾细胞癌，欧元J癌症（ 2014年） ，包含http://歧视患者
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在CCD获得的模型。根据计算结果，
整体最优值和萃取条件，
所研究的范围内，则有：培养时间
9分钟， 24分钟提取一次，0.59克盐加
和提取在68 ？ C。
3.2 。挥发性配置文件作为判别工具
证明该挥发性轮廓可以是概念
在尿液从RCC患者的歧视使用
和健康对照组，无监督统计方法
（PCA ）是适用。所得到的结果示于
图。 6，尽管在高的个体差异
泌尿访问，特别是在控制
组，而事实上，这组变量只能
解释的变异的60.33 ％的第2间
主成分（ PC1和PC2 ） ，这些探索
结果仍然看好。
4，结束语
可能使用的挥发性尿轮廓来
鉴别病理条件下有报道，
至少，自1971年[ 51 ] 。这些作品极大地凸显
尿液的挥发性仿形因为它避免了潜在的
一些与GC / MS分析尿液分析相关的挑战
[38] 。然而，考虑到HSSPME的高灵敏度
到可能影响实验条件
的分布和吸收/吸附率
化合物中，关键的是要优化和控制那些
在提取过程中的实验变量。
在这里，我们描述了开发和优化
的HS-SPME方法对尿分析
人体代谢。本研究的主要优点
是使用一种实验设计，使之
研究多个变量同时作用。
在加上一个中央特别设计的阶乘
复合设计（ CCD）的一些优化
参数是已知的干扰的提取
效率，因为CCD能使之间可能的相互作用研究
他们之间。结果表明， pH值，
光纤涂料和提取温度的强烈影响
总色谱峰面积。最佳
提取条件为挥发人类的分析
尿代谢被认为是：酸性pH值（2） ，
DVB / PDMS纤维涂层，另外0.59克氯化钠，
培养和提取在68 ？的C期间9分钟
24分钟。
在开发和优化HS-SPME法是
在患病之间（ RCC）的歧视待遇
和正常的尿液样本，显示希望的结果
这将在不久的将来进行探讨，以提高其
适用性。
