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【ABP头脑风暴第五弹】酵母双杂交的吃饭问题

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某一弹的时候说到,转入AD或者BD的酵母是通过营养缺陷的培养基来筛选的,好吧,我先来介绍一下酵母培养基的基本情况。
完全培养基:YPDA,酵母提取物 + 葡萄糖 + 腺嘌呤 + Agar
选择培养基:SD/缺,碳源是 葡萄糖, 氮源是 无氨基酸酵母氮源(说白了就是不含氨基酸的氮源), DO(dropout,16?种氨基酸的混合物),X-α-gal(报告基因所用,会变蓝绿色),Agar, 色氨酸/亮氨酸/组氨酸/腺嘌呤(四种营养缺陷筛选所用的)
我们用的酵母双杂交的菌种是AH109(MATa)或者Y187(MATα)它自身不能合成色氨酸/亮氨酸/组氨酸/腺嘌呤,而
AD的质粒pGADT7上含有合成亮氨酸的基因
BD的质粒pGBKT7上含有合成色氨酸的基因
AD、BD能够激活的报告基因除了LacZ(β半乳糖苷酶,能使X-gal变蓝),还有
组氨酸的合成基因
腺嘌呤的合成基因
MEL1,α-半乳糖苷酶
,能使X-α-gal变蓝
(clonetechY2H操作手册)
培养基中缺失腺嘌呤的酵母AH109,会长成红色克隆,被认为是衰老的酵母,不适宜用于实验。
那么问题就来了:
1、猜想,神秘的Agar在这里是什么作用?
2、是设计营养缺陷的培养基,让它上面只能生长:转入了AD的酵母;转入了BD的酵母;同时转入了AD和BD的酵母;同时转入了AD和BD并且融合蛋白发生相互作用的酵母
3、一般我们将AD、BD两种质粒同时转入酵母,那么根据AH109和Y187的配子型,如何有效地提高这种共转的效率?
4、**试设计制作酵母彩虹的方案(含有红色到蓝色酵母克隆)


IP属地:浙江本楼含有高级字体1楼2013-07-20 20:31回复
    →_→每弹二楼都是我,真不好意思


    IP属地:上海来自Android客户端2楼2013-07-20 20:40
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      2026-01-27 03:25:34
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      http://tieba.baidu.com/p/2455210743?pid=35398252495&cid=#35398252495
      第三弹关于酵母的背景


      IP属地:浙江3楼2013-07-20 20:40
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        小伙伴们快来啊


        IP属地:浙江4楼2013-07-20 21:45
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          1,琼脂是一种神奇的东西指教培养基凝成个饼子
          2,A培养基不含ile,B培养基不含trp,C培养基不含ile,trp,D培养基在C基础上加点x-gal
          3,不了解。。。。。
          4,用选择培养基?里面加啥能变色就不知道了


          IP属地:上海5楼2013-07-20 23:06
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            我真期望什么时候我能看懂


            来自Android客户端6楼2013-07-20 23:57
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              看着一堆各式各样的氨基酸压力巨大
              1、Agar不就是琼脂嘛。不神秘,培养基凝固剂……(记得很清楚,因为我们讲选修1微生物培养的时候老师用的ppt里面莫名出现了这个词……)
              2、SD/-Leu,SD/-Trp,SD/-Trp/-Leu,最后那个,看报告基因
              如果是LacZ,那就是SD/-Trp/-Leu/X-gal
              如果是MEL1,那就是SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal
              如果是HIS3,那就是SD/-Trp/-Leu/-His
              如果是ADE2,那就是SD/-Trp/-Leu/-Ade
              (不要吐槽,我就是想要享受下这种貌似高端洋气的感觉- -)
              3、其实一开始没弄明白什么是提高共转效率- -后来我没弄清楚这和AH109或Y187两种酵母有什么特殊的关系,我所知的是这样的,即酿酒酵母有性生殖有两种接合型(α和a),不同接合型配子相遇接合能形成二倍体,而同种相遇则不能。所以,我想保证转入AD和转入BD的菌种是不同接合型就好(这个具体怎么筛选菌种不是很清楚,不过考虑到同接合型不能生殖,应该不是很难吧。)然后像刚刚那样,利用前两种筛选培养基初步筛选,长出菌苔之后,把两种酵母影印到第三个培养基中筛选,原则上能存活的就只有成功被共转染的二倍体酵母了~
              4、彩虹酵母……听起来好腻害的样纸。我好奇的是这种东西除了好看之外有什么用处当然如果只是想想,那就不需要什么用处了
              我不晓得能不能制作有明显分层的培养基,我的想法是这样的。为了保证彻底分层,一个报告基因显然不够,酵母菌种里面必须要有两个报告基因。另外真心没有实际看过这些培养基培养出来变成什么颜色,具体颜色可能有偏差……
              我想只是想要变色的话,就不导入质粒了,因此-Trp和-Leu的条件就不要了
              i)利用SD/-His/X-gal培养基筛选出能让X-gal变蓝的酵母菌菌种A,导入HIS3基因是为了分层,避免预先安排给其它颜色的酵母菌跑来干扰
              ii)利用SD/-Ade/X-α-Gal培养基筛选出能让X-α-Gal变蓝绿的酵母菌菌种B,导入ADE2也是为了分层
              黄色应该算是自然颜色,就正常的SD培养基上能长的任意酵母菌都可以用吧- -;红色也不需要筛选,自然的营养缺陷种就缺乏Ade,就用有缺陷的AH109就好了
              ok,现在制作分层的培养基,自上而下分别是SD/-His/X-gal,SD/-Ade/X-α-Gal,SD,SD/-Ade,然后给四个部分分别接种菌种A,菌种B,任意菌种,AH109,ok,大功告成,自上而下:蓝,蓝绿,黄,红,这个应该差不多了吧~
              另外貌似LS说的不同种酵母菌落颜色不同是真的……具体情况不明


              7楼2013-07-21 04:23
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                1,我才知道Agar是琼脂。。。。
                2.1缺亮氨酸选择培养基
                2.2缺色氨酸……
                2.3缺亮氨酸色氨酸…………
                2.4缺组氨酸…………
                3,低色氨酸亮氨酸高钙离子载体液体培养基?(我不知道该怎么命名。。。)
                4,允许用染料么?


                来自Android客户端8楼2013-07-21 10:36
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                  2026-01-27 03:19:34
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                  渣渣表示看不懂。。


                  来自Android客户端10楼2013-07-21 16:32
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                    理解起来有点困难


                    11楼2018-10-25 22:15
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