我的问题来自一个TA cloning实验。所谓TA cloning，就是利用taq酶会在双链DNA 的3’尾部加一个未配对A碱基的原理，人工制造一种有缺口的质粒，缺口处分别在两端的3’处有一个未配对T碱基，那么这个T便能和经taq处理过的PCR产物尾部的A进行配对(图1)。这个方法比常规分子克隆的酶切再连接要简单方便很多。

在我用TA cloning将我的gene接到TA vector(pCRII vector)上后，为了确定我的基因的插入方向，我以这个质粒为模板做了四组PCR，一个primer在我的基因上(图2的primer 1)，另一个primer分别是是T7, SP6, M13 F 和 M13 R。

于是我的预期结果便是：要么primer 1 + T7 和primer 1 + M13 F 有产物而另外两对没有，或者反过来。
奇怪的结果产生了：四组PCR都扩出了大小基本一致的产物，也就是说两种插入方向的质粒混在了一起。然后我送过去测序，以M13F或M13R为测序primer。
我的预期结果是：如果真的混有两种方向的质粒，那么测序应该测不出来，大部分碱基的峰值都会很乱。
可是，测序结果正常，只有一种插入方向！
那么问题便是：为什么明明只有一种插入方向，PCR却能扩出两种方向？
并且，这个现象非常的reproducible，我克隆其它片段时也遇到了同样的情况。

PS 1：图3是pCRII质粒的信息
PS 2：如果有不错的实验设计想法，我可以考虑做一做。
PS 3：如果有做过TA克隆的朋友，可以试一试，看会不会遇到同样的问题。