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1.1.4 同位素及非同位素试剂盒 用于DNA序列测定的a 32P-dCTP购于北京亚辉生物医学工程公司, 用于DNA探针标记的非同位素地高辛(digoxigenin-11-dUTP)试剂盒购于Boehringer公司. 
1.2 方法
1.2.1 DNA提取和纯化 质粒DNA, 染色体DNA的提取按文献[4,5]方法进行. DNA纯化及DNA片段的回收按文献[5]进行. 
1.2.2 引物设计及PCR技术 引物1：5′-GCGTCAACCGGACCGTCG-3′; 引物2：5′- CGCCGTGGGTGAGGGTG-3′, 均由中国科学院微生物研究所技术室合成, 用于基因内部片段的扩增, 扩增方法按文献[6]进行. 
1.2.3 DNA探针标记 按文献[3]方法进行. 
1.2.4 DNA Southern blot杂交 按文献[3]方法进行. 
1.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 按文献[4]方法进行. 
1.2.6 链霉菌原生质体制备、再生及转化 按文献[3,5]方法进行. 
1.2.7 单链DNA的制备及序列测定 按文献[3]方法进行. 
1.2.8 DNA完整序列的分析及可读框分析 分别用Frameplot 2.2程序及Blast X程序完成. 
1.2.9 基因的同源比较 用Blast X程序在基因库中进行比较分析.
1.2.10 基因功能研究 利用基因破坏策略, 选用载体pKC1139为介导, 与结构基因内部的部分片连接, 构建后的重组质粒转化到分化野生型链霉菌后, 在42℃及Apramycin抗性压力下, 该质粒不能复制, 只能通过所携带的基因内部分片段与染色体的同源区域交换, 整合到染色体上而存在, 这种整合由于载体的插入使染色体上完整的基因分成两个部分, 使基因的正常功能被破坏. 以野生型为对照, 观察该破坏子的表型及形态变化, 可推测野生型中正常基因的功能.
1.2.11 基因功能互补 将完整的含有启动子区域的基因克隆于pSET152的EcoRⅤ位点上, 之后来源于pIJ963的潮霉素抗性基因被插入到pSET152::scrX的BamHⅠ位点. 该重组质粒转化到破坏子中, 在含Apramycin和Hygromycin的基本培养基平板上, 挑选正确的整合互补克隆；在Apramycin基本培养基平板上, 以野生型和破坏子为对照, 观察互补克隆的表型恢复. 

2 结果
2.1 DNA片段的克隆
　　PTH4控制的基因可读框下游紧邻的KpnⅠ/PvuⅡ片段 (170 bp)被制备成探针, 在与天蓝色链霉菌总DNA 的supercosmid文库进行杂交后, 得到了两个阳性克隆(图略), 编号分别为E51, E119, 其插入片段大小为40 kb左右. 为了得到便于操作的DNA片段, 用BglⅡ等限制性内切酶对E51, E119进一步酶切, 以J1501总DNA的相应酶切为对照. 通过琼脂糖凝胶电泳(图1(a))及Southern blot杂交(图1(b)), 发现几乎所有酶切中的E51和 E119 DNA 片段都与J1501所得阳性信号相同. 其中, BglⅡ酶切E51和E119所得到的阳性信号带相对较大, 为7.0 kb, 含有完整基因的可能性最大, 可作为初步克隆. 将该7.0 kb DNA片段回收, 并连接到M13-中而获得重组质粒；在此基础上为了得到便于功能研究的DNA片段, 该重组质粒进一步用KpnⅠ等限制性内切酶进行了酶切, 经琼脂糖凝胶电泳和Southern blot杂交, 所有酶切结果都给出单一阳性信号. 其中KpnⅠ切出的1.4 kb的KpnⅠ阳性信号DNA片段, 是紧邻PTH4所控制的下游基因的DNA片段且大小基本满足单基因的长度, 因此该DNA片段被回收和纯化(图2).

图1 天蓝色链霉菌J1501 总DNA, supercosmid E51 和E119 DNA 的酶切琼脂糖凝胶电泳(a)
及Southern blot 杂交(b)
1, 4, 7, 10 和13 为J1501 总DNA 分别用Bgl ,Kpn ,Pvu , Sma 和Sst 酶切; 2, 5, 8, 11 和14 为E51 DNA 分别用Bgl , Kpn , Pvu , Sma 和Sst 酶切; 3, 6, 9, 12 和15 为E119 DNA 分别用Bgl , Kpn , Pvu , Sma 和Sst 酶切;16 为Spp1 被EcoR 酶切的标准分子量对照

图3 scrX 基因的DNA 序列及推测的氨基酸序列
-10 和-35 为可能的启动子区域RBS 为核糖体结合位点AAA ( 17 位的赖氨酸 ) AAA ( 34 位的赖氨酸 ) ATA ( 95位的异亮氨酸 )为3 个稀有密码子( 及相应的氨基酸 ) 400 417 为引物1 合成所依照的DNA 序列, 782 798 为引物2合成所依照的序列

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大家咋米拉??????

图8 破坏子的互补实验
(a) J1501/pKC1139 野生型(灰色) , (b) 破坏子36 (白色),© 破坏子36 /pSET152::scrX::hyg r (灰色)

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爱爱DD榜上有名嘛，呵呵~~~~ ^o^
这个东西太高深了，偶没看懂，要是给灵灵DD看看，也许他会很感兴趣，他喜欢生物学的说~~~ ^o^

我~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~呵呵

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刷~

我晕，我想要pSET152!