收集包含体
破碎含包含体的宿主细胞
通常使用机械破碎法，如高压匀浆法、超声波破碎法、超声波结合溶菌酶破碎等
离心收集包含体
包含体具有很高的密度，在细胞裂解后可通过低速离心收获
为防止细胞碎片共沉淀，裂解方法和离心力的选择尤为重要
洗涤包含体
为了除去包含体上粘附的杂质，如膜蛋白、核酸、脂质等
洗涤液通常是含去污剂Triton X-100、脱氧胆酸盐、低浓度的变性剂尿素、盐酸胍等的缓冲液溶解包含体
注意点：洗涤液浓度
一般采用强的变性剂
◼ 常用盐酸胍浓度5~6mol/L、尿素浓度6~8mol/L、SDS1%~2%（W/V）
加入还原剂，打开错配的二硫键
◼ 二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、半胱氨酸等
加入金属鳌合剂如EDTA等，防止已处于还原状态的巯基与金属离子发生反应
重组蛋白质的复性
为了得到具有天然构象的蛋白质和产生正确配对的二硫键，必须去掉过量的变性剂和还原剂，并使多肽链处于一个氧化性的缓冲液中
通过稀释法把变性溶解的蛋白质直接加入到复性液中
通过透析、超滤或凝胶过滤法完全去掉变性剂和还原剂
蛋白质的复性是十分复杂的过程，其中目标产物的复性率非常低
原因是当变性剂移走后，蛋白质分子可能重新聚合。生成二聚体、三聚体或多聚体，甚至形成变性沉淀物
复性过程中注意因素
蛋白质浓度
复性溶液的pH、温度和时间
恰当的氧化还原条件
添加低分子化合物
添加分子伴侣和折叠酶......

过滤与离心技术深度解析
生化产品通常利用机械方法进行固液分离
常用过滤和离心分离
过滤是以某种多孔性物质作为介质，在外力的作用下，悬浮液中的流体通过介质孔道，而固体颗粒被截留下来，从而实现固液分离的过程
离心是借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小，不同密度的粒子分离的技术
一、过滤技术
1，按料液流动方向不同，过滤可分为常规过滤和错流过滤
料液流动方向 适用场景：
常规过滤 料液流动方向与过滤介质垂直（死端过滤）低固含量（<0.1%）、澄清过滤
错流过滤 料液流动方向平行于过滤介质（切向流） 高固含量（>0.5%）、连续操作


错流过滤 ——又称切向流过滤。
错流过滤优势：
能连续清除过滤介质表面的滞留物，使滤饼不能形成，整个过滤中能保持较高的过滤速度，通量提升 3-5倍（膜表面剪切力防堵塞）
错流过滤在料液固形物含量高于0.5%、处理量大时有明显优势，固形物截留率 >99%（如微滤膜截留0.1μm颗粒）
2，按过滤机理的不同，常规过滤可分为深层过滤和滤饼过滤
类型 核心机制 过滤介质材料 适用固含量
深层过滤 颗粒吸附/截留于介质内部 硅藻土、砂、颗粒活性炭、砂滤层、塑料颗粒 <0.01%
滤饼过滤 颗粒架桥形成滤饼层 滤布、金属筛网、微孔膜 、织物、多孔材料等，孔径可大于最小颗粒的粒径。 >0.1%
深层过滤
将过滤介质填充于过滤器内构成过滤层。过滤时，悬浮液通过滤层，滤层上的颗粒阻拦或者吸附固体颗粒，使滤液澄清，固体颗粒被阻拦或吸在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，这种方法也叫做澄清过滤
过滤介质在过滤中起主要作用

滤饼过滤(表面过滤)
过滤初期，部分小颗粒可以进入或穿过介质的小孔，后因颗粒的架桥作用使介质的孔径缩小形成有效的阻挡
被截留在介质表面的颗粒形成滤渣层（滤饼），透过滤饼层的则是被净化了的滤液
随滤饼的形成，真正起过滤介质作用的是滤饼，而非过滤介质本身，故称作滤饼过滤
滤饼过滤主要用于含固量较大（>0.1%）的场合

二、离心技术
1，依靠惯性离心力的作用而实现的沉降过程称为离心，
离心是借助离心机旋转所产生的离心力的作用，促使不同大小，不同密度的粒子分离的技术
对于两相密度差较小，颗粒粒度较细的非均相体系，在重力场中的沉降效率很低，甚至不能完全分离，若改用离心可以大大提高沉降速度。对比重力沉降：离心分离速度提高 100–10,000倍（如细胞分离时间从小时级缩短至分钟级）

2. 离心技术分类
类型 分离原理 适用场景 离心力范围 关键操作要点
超离心 沉降系数/浮力密度综合分离。根据沉降、质量和形状不同，应用强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法 病毒纯化、脂蛋白分离 >100,000×g 控温（±0.5℃）、防震动
差速离心 沉降速度差异分批分离 一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒，如细胞碎片去除、粗分离 500–5,000×g 阶梯升速（低速→高速交替）
密度梯度离心 颗粒密度差异分层 亚细胞器、病毒、DNA分离 10,000–100,000×g 梯度介质精确配制
差速离心法
采取逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批分离的方法
优势：处理量大，处理量 >1L（工业连续流离心机）
劣势：操作繁杂，交叉污染率 15-30%（沉淀夹带上清），仅适用沉降系数差异 >10倍 的颗粒
操作流程：
A[样品匀浆] --> B[500×g 10min → 沉淀细胞核]
B --> C[上清 → 10,000×g 20min → 沉淀线粒体]
C --> D[上清 → 100,000×g 60min → 沉淀微粒体]

密度梯度离心
指液相介质密度在同一样品或离心管内是不均一的，自离心管上部到下部管底介质密度逐渐增大，由此在同一离心管内的液相介质密度形成一定的密度梯度，这种递增的介质密度可以是连续的，也可以是不连续的。样品在这一惰性梯度介质中进行离心沉降或离心平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法
常用的密度梯度介质有：蔗糖、甘油、氯化铯（DNA 分离）、硫酸铯（RNA分离）、右旋糖酐、聚蔗糖，溴化钠（脂蛋白分离）等

密度梯度离心细分：
子类 梯度介质要求 典型应用
差速-区带离心 介质密度<颗粒最小密度 核糖体亚基/线粒体分离（蔗糖梯度）
梯度介质：蔗糖/甘油（低粘度、惰性）
等密度梯度离心 介质密度覆盖颗粒密度范围 DNA纯化（CsCl梯度）、脂蛋白分离
差速区带离心法
当不同的颗粒间存在沉降速度差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度的不同区域上形成区带的方法称差速-区带离心法
分离机制：
颗粒按 沉降速度（S值） 分层：大颗粒→管底，小颗粒→上层
离心条件：100,000×g, 4℃, 3h
差速-区带离心仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒
在差速区带离心时,一般要求介质中的最大密度小于样品中固相物质的最小密度
应用案例：
核糖体亚基分离：
30S亚基 → 梯度中部（密度≈1.15 g/mL）
50S亚基 → 梯度下部（密度≈1.18 g/mL）
密度梯度的作用主要是为了克服离心时由于震动和温差所产生的对流作用，防止扰乱界面，维持离心沉降力的稳定性
等密度梯度离心
操作公式：
ρ=1.66/（1+0.0092×DNA%GC）(DNA浮力密度计算)
密度梯度的范围包括分离样品中所有颗粒的密度
CsCl梯度优化：
初始密度：1.7 g/mL → 离心后DNA区带密度≈1.72 g/mL
条件：140,000×g, 20℃, 48h
当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到与它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，这种方法即等密度离心法，也叫沉降平衡法
优势：
分辨率极高（密度差 ±0.001 g/mL 可分离）
回收率 >95%（超纯DNA）
技术对比与选择策略
参数 差速离心 差速-区带离心 等密度离心
分离依据 沉降速度 沉降速度 浮力密度
分辨率 低 中 高
处理量 大（工业级） 中（实验室） 小（微量）
时间成本 短（<2h） 中（3-5h） 长（>24h）
工业应用警示
梯度介质毒性：
CsCl需彻底透析去除（透析膜截留MW<10 kDa）
离心力超限风险：
超速离心（>100,000×g）需钛合金转子（防爆）
温度控制：
蔗糖梯度离心需 4℃（防热对流破坏梯度）

掌握要点：
生物材料选取有哪些要求？注意点？
生物材料预处理的目的？
发酵液的预处理目的？方法？——凝聚、絮凝等
细胞破碎有哪些方法？ 基本原理是什么？
破碎率及测定方法？
包含体、包含体形成的主要原因？
包含体提取的一般操作步骤
包含体分离、洗涤和溶解，蛋白质复性的方法
固液分离有哪些方法？各有何特点？
什么是过滤？有哪些方法？
什么是离心？有哪些方法？
以下针对生物分离纯化核心要点进行系统梳理，结合理论与工业实践：
一、生物材料选取要求与注意点
| 要求 | 注意点 |
| 目标产物含量高 | 优选基因工程菌（如大肠杆菌表达系统）或特定组织（动物胰脏提取胰岛素） |
| 杂质干扰少 | 避免含酚类/脂质组织（植物材料需脱酚预处理） |
| 生长周期短 | 微生物优选对数生长期（OD600=0.6-0.8）收获 |
| 遗传稳定性好 | 工程菌需抗性筛选（如质粒丢失率<1%） |
| 安全性 | 排除病原体（如CHO细胞需检测支原体） |
二、生物材料预处理目的
1. 灭活代谢酶：防止目标产物降解（如蛋白酶抑制剂PMSF）
2. 去除干扰物：脂质/色素/核酸（CTAB沉淀DNA）
3. 增加通透性：冻融破坏细胞膜（-20℃→37℃循环）
4. 浓缩目标物：超滤切向流浓缩（10kDa膜包）
三、发酵液预处理
目的：
- 降低粘度（核酸酶降解DNA）
- 去除高价金属离子（EDTA螯合）
- 固液分离增效
方法：
| 技术 | 机制 | 效果 |
| 凝聚 | 电荷中和（Al³⁺/Fe³⁺） | 粒径↑50%，沉降速度↑3倍 |
| 絮凝 | 高分子架桥（聚丙烯酰胺） | 絮团直径>100μm，过滤通量↑5倍 |
| 热处理 | 蛋白变性沉淀（60-80℃） | 杂蛋白去除率>70% |
| pH调节 | 等电点沉淀（pH=pI±0.5） | 选择性沉淀目标蛋白 |
四、细胞破碎方法
机械法：
| 方法 | 原理 | 适用场景 |
|------------------|-------------------------------|---------------------------|
| 高压匀浆 | 剪切力（>1000 bar） | 大肠杆菌（破碎率>95%） |
| 超声破碎 | 空化效应（20kHz） | 实验室规模（<500mL） |
| 球磨破碎 | 研磨碰撞（玻璃珠直径0.5mm） | 酵母/植物细胞 |
非机械法：
- 酶解法：溶菌酶（0.1-1mg/mL）破壁
- 化学法：Triton X-100溶解膜蛋白
- 渗透压冲击：0.5M蔗糖预处理→水稀释
五、破碎率测定方法
1. 直接计数法：
破碎率=(1−N/N0)×100
（N：完整细胞数；N₀：总细胞数）
2. 释放物检测：
- 胞内酶活性（如乳酸脱氢酶释放量）
- 导电率变化（K⁺离子泄漏）
六、包涵体（Inclusion Bodies）
形成原因：
- 原核系统缺陷：缺乏真核折叠伴侣（如PDI）
- 疏水区暴露：重组蛋白疏水残基聚集（如胰岛素A链）
- 高表达速率：表达速度>折叠速度（>50mg/L/h）
提取步骤：
A[细胞破碎]
--> B[离心收集 10,000×g 30min]梯度离心升级
B --> C[洗涤：2% Triton X-100 + 1M NaCl]去膜杂质去核酸去内毒素
C --> D[溶解：8M尿素 + 10mM DTT]高效变性剂组合
七、包涵体复性技术
| 方法 | 原理 | 复性率 |
| 稀释复性 | 快速降低变性剂浓度 | 10-30% |
| 透析复性 | 梯度去除变性剂（12h阶梯透析） | 20-40% |
| 层析复性 | HIC/SEC分离聚集体 | 40-70% |
| 氧化还原调控 | GSH/GSSG动态调节二硫键 | 正确配对>90% |
> 关键参数：蛋白浓度 0.1-0.5mg/mL，pH 8.0-8.5，温度 4-10℃
八、固液分离技术对比
| 技术 | 分离原理 | 适用粒径 | 工业场景 |
| 过滤 | 介质截留 | >0.1μm | 发酵液初滤（硅藻土） |
| 离心 | 密度差沉降 | 0.01-100μm | 细胞分离（碟片离心机） |
| 超滤 | 分子筛分 | 1-100nm | 蛋白浓缩（切向流） |
九、过滤技术分类
常规过滤：
- 深层过滤：介质内部截留（砂滤精度>5μm）
- 滤饼过滤：表面架桥形成滤饼（板框压滤）
错流过滤：
- 切向流设计：料液平行膜面流动（通量提升3倍）
- 抗污染机制：剪切力清除膜面沉积（流速>2m/s）
十、离心技术分类
| 类型 | 分离基础 | 典型应用 |
| 差速离心 | 沉降速度差异 | 细胞碎片去除（500-5,000×g） |
| 密度梯度离心 | 颗粒密度差异 | |
| - 差速区带离心 | 沉降系数差异 | 核糖体分离（蔗糖梯度） |
| - 等密度离心 | 浮力密度差异 | DNA纯化（CsCl梯度） |
> 超离心参数：>100,000×g（如病毒颗粒分离）
核心要点总结
1. 预处理关键：凝聚/絮凝提升后续分离效率
2. 破碎选择：机械法（规模）+ 酶解法（温和）
3. 包涵体复性：层析复性 + 动态氧化还原为最优解
4. 分离技术：
- 高固含量 → 错流过滤/离心
- 纳米级分离 → 超滤/等密度离心