WB小技能
1.如何才能跑出漂亮的胶？
配胶：洗净玻璃板，并检漏（玻璃板漏会导致胶凝固不均匀）；倒胶时要0充分混匀（超声除去气泡）；双蒸水或乙醇隔离时，缓慢加入，避免稀 释分离胶；胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。
平衡：将配置好的胶放入点泳池，室温放置10min,待胶与电泳液温度
一致再进行电泳。
上样：拔上样梳保持水平，避免上样孔倾斜；另在样品空两侧增加等体
积空白1x loading buffer孔避免两侧样品条带扩宽。
电泳：小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V,分离胶75V电泳效果最佳，但时间长。
2.电泳中常出现的一些现象：
条带呈笑脸状--原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；电泳系统温度偏高，而且电场强度太大
"一”条带呈皱眉状--原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
条带拖尾--原因：样品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。
纹理（纵向条纹）--原因：样品中含有不溶性颗粒，可能抽提蛋白时出了问题。
条带偏斜…-原因：电极不平衡或者加样位置偏斜，一定要子平面台子上电泳，胶要做好。
条带两边扩散--原因：加样量过多，弥散至孔周围了，减少上样量或者使用5X上样缓冲液。
3. WB结果中背景较高，可能的原因及建议：
膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。
一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高，建议4°C过夜孵育。
膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要保持膜的湿润，使用银子夹取膜。检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。
4. WB结果中杂带较多，可能的原因及建议：
目的蛋白有其它剪切本，查阅文献或生物信息学分析其可能性。
样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制0剂；样本处理在冰上操作。
上样量过高，过于敏感，适当减少上样量。
一抗特异性不高，重新选择或制备高特异性的抗体。
一抗不纯，纯化抗体。
一抗或者二抗浓度偏高，适当降低抗体浓度
5.WB结果中无信号或显示信号弱，可能的原因及建议：你所检测的样本中不表达目的蛋白，选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性
检测样本低表达目的蛋白，提高上样量
一抗孵育时间不足，建议4°C结合过夜
二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体
洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1 %的弱去垢剂
1.如何才能跑出漂亮的胶？
配胶：洗净玻璃板，并检漏（玻璃板漏会导致胶凝固不均匀）；倒胶时要0充分混匀（超声除去气泡）；双蒸水或乙醇隔离时，缓慢加入，避免稀 释分离胶；胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。
平衡：将配置好的胶放入点泳池，室温放置10min,待胶与电泳液温度
一致再进行电泳。
上样：拔上样梳保持水平，避免上样孔倾斜；另在样品空两侧增加等体
积空白1x loading buffer孔避免两侧样品条带扩宽。
电泳：小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55V,分离胶75V电泳效果最佳，但时间长。
2.电泳中常出现的一些现象：
条带呈笑脸状--原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；电泳系统温度偏高，而且电场强度太大
"一”条带呈皱眉状--原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
条带拖尾--原因：样品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。
纹理（纵向条纹）--原因：样品中含有不溶性颗粒，可能抽提蛋白时出了问题。
条带偏斜…-原因：电极不平衡或者加样位置偏斜，一定要子平面台子上电泳，胶要做好。
条带两边扩散--原因：加样量过多，弥散至孔周围了，减少上样量或者使用5X上样缓冲液。
3. WB结果中背景较高，可能的原因及建议：
膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。
一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高，建议4°C过夜孵育。
膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要保持膜的湿润，使用银子夹取膜。检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。
4. WB结果中杂带较多，可能的原因及建议：
目的蛋白有其它剪切本，查阅文献或生物信息学分析其可能性。
样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制0剂；样本处理在冰上操作。
上样量过高，过于敏感，适当减少上样量。
一抗特异性不高，重新选择或制备高特异性的抗体。
一抗不纯，纯化抗体。
一抗或者二抗浓度偏高，适当降低抗体浓度
5.WB结果中无信号或显示信号弱，可能的原因及建议：你所检测的样本中不表达目的蛋白，选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性
检测样本低表达目的蛋白，提高上样量
一抗孵育时间不足，建议4°C结合过夜
二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体
洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1 %的弱去垢剂
